Подсчет тромбоцитов в камере горяева


Подсчет количества тромбоцитов в счетной камере Горяева

Принцип. Подсчет числа тромбоцитов в разведенной крови в счетной камере с применением фазово-контрастного устройства и расчет их количества в 1 мкл или 1 л крови.

Реактивы: 1) реактив 1: кокаина гидрохлорид — 3 г; натрия хлорид — 0,25 г; фурацилин — 0,25 г; дистиллированная вода— 100мл; 2) реактив 2: 1% раствор оксалата аммония. Раствор кипятят и фильтруют, хранят в холодильнике.

Наиболее быстрый и полный лизис эритроцитов вызывает 1% раствор оксалата аммония.

Ход определения. Для подсчета тромбоцитов предпочтительнее использовать венозную кровь. В качестве антикоагулянта рекомендуется применять ЭДТА (этилендиаминтетраацетат натрия). При взятии капиллярной крови из пальца высока вероятность агрегации тромбоцитов. Перед исследованием необходимо убедиться в отсутствии сгустков крови.

Исследуемую кровь разводят в 200 раз, для этого в сухую пробирку набирают 4 мл реактива 1 или 2 и 0,02 мл крови. Перемешивают и оставляют на 25–30 мин для гемолиза эритроцитов. Подготавливают камеру Горяева и заполняют ее предварительно перемешанной разведенной кровью (см. «Подсчет эритроцитов, лейкоцитов»). Счетную камеру помещают во влажную среду (чашка Петри с уложенной по краям смоченной водой фильтровальной бумагой) на 5 мин для оседания тромбоцитов. Используя объектив 40× с фазово-контрастным устройством, производят подсчет тромбоцитов в 25 больших квадратах счетной камеры.

Тромбоциты выглядят в счетной камере как мелкие, хорошо преломляющие свет образования.

Расчет числа тромбоцитов в 1 мкл крови проводят по формуле:

где X — число тромбоцитов в 1 мкл крови; а — число тромбоцитов, сосчитанных в 25 больших квадратах счетной камеры; 200 — разведение крови; 25 — число больших квадратов; 250–1(1/250) — объем одного большого квадрата, так как сторона квадрата равна 5–1 мм, а высота — 10–1 мм.

На практике число сосчитанных тромбоцитов умножают на 2000. При пересчете на 1 л крови умножают еще на 106.

Примечание. Вся используемая стеклянная посуда и камера Горяева должны быть тщательно вымыты, иначе грязевые и пылевые частицы, сходные по размеру с тромбоцитами, могут быть ошибочно учтены при подсчете.

См. также:

onlab.info

Определение числа тромбоцитов в крови

Число тромбоцитов: микроскопический метод.

.

Определение числа тромбоцитов — важнейший метод исследования, способный обнаружить наиболее частое нарушение гемостатического потенциала крови — тромбоцитопению. В настоящее время для определения числа тромбоцитов имеется несколько лабораторных технологий (автоматизированный, по Фонио и др.). Наибольшую точность имеет микроскопический метод при подсчете в камере, однако этот метод требует от врача-лаборанта опыта, напряжения зрения, концентрации внимания.

Принцип метода

Принцип метода основан на определении числа тромбоцитов путем их подсчета в камере Горяева обычной световой микроскопией или с помощью микроскопа с фазово-контрастной приставкой после разведения крови и гемолиза эритроцитов раствором оксалата аммония.

С целью повысить точность микроскопического метода число тромбоцитов подсчитывают в двух камерах, затем вычисляют среднюю арифметическую.

Реактивы и оборудование

Образцы крови для исследования

Определение числа тромбоцитов возможно в крови, стабилизированной цитратом натрия или нанесенным на стенки пластиковой пробирки мелкодисперсным порошком этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА). При использовании микроскопического метода предпочтительнее брать кровь на цитрате натрия, чтобы исключить влияние ЭДТА на результаты подсчета тромбоцитов.

Техника выполнения

В сухую пластиковую пробирку вносят 1,98 мл 1% оксалата аммония и 0,02 мл крови. Медленно и аккуратно перемешивают смесь в течение 2 мин, а затем ее инкубируют в течение 20 мин при комнатной температуре. Далее заполняют две камеры Горяева содержимым пробирки и на 10 мин помещают их в чашку Петри, в которой находится влажная марля или смоченный фильтр. После этой инкубации, которая необходима для оседания тромбоцитов, подсчитывают их число в 25 квадратах. Среднюю арифметическую результатов подсчета в двух камерах умножают на 1000. При исследовании цитратной крови результат увеличивают на 10 % и умножают на 1000, что позволяет корректировать разведение венозной крови раствором натрия цитрата.

Оценка результатов исследования

У здорового человека число тромбоцитов в периферической крови колеблется в довольно широком диапазоне — от 150 до 400 х 109/л.

Недопустимо исследование числа тромбоцитов в охлажденных образцах крови. При гемолизе возможно занижение числа тромбоцитов. В ряде случаев при исследовании числа тромбоцитов на гематологических анализаторах встречается так называемая псевдотромбоцитопения, обусловленная агрегацией и группировкой тромбоцитов в присутствии ЭДТА. Эту проблему решает забор крови на цитрате натрия.

Для обеспечения контроля качества при подсчете числа тромбоцитов на гематологических анализаторах существуют контрольные образцы с разным содержанием этих клеток. О возможности использования этих образцов для обеспечения контроля качества при подсчете числа тромбоцитов микроскопическим методом не существует общепринятых рекомендаций. Для повышения точности результатов микроскопического исследования следует периодически контролировать воспроизводимость результатов определения числа тромбоцитов разными лаборантами в течение рабочего дня и на основе полученных данных повышать точность и снижать вариацию при выполнении этой методики Коэффициент вариации микроскопического метода у опытных лаборантов не превышает 10 %.

Интерпретация результатов исследования

В клинической картине тяжелого течения идиопатической тромбоцитопенической пурпуры доминирует геморрагический синдром. При вторичных тромбоцитопениях геморрагический синдром, как правило, умеренный, и сочетается с клиническими симптомами основного заболевания, обусловившими тромбоцитопению. В тех случаях, когда число тромбоцитов менее 100 х 109/л длительно наблюдается без каких-либо проявлений фонового заболевания, следует думать об идиопатической тромбоцитопенической пурпуре.

Тромбоцитозы также наблюдаются при миелопролиферативных заболеваниях. Нередко на фоне миелопролиферации отмечают нарушения реологических свойств крови за счет полиглобулии. В последнем случае, а также при числе тромбоцитов более 700 х 109/л у пациентов повышается риск тромбозов. Однако на фоне миелопролиферативных заболеваний, сопровождающихся тромбоцитозом более 1500 х 109/л, парадоксально наблюдается геморрагический синдром.

При тромбоцитопении и наличии геморрагического анамнеза с раннего детского возраста весьма важно оценить размер тромбоцитов, в т. ч. MPV (средний объем) в мазке крови, а также наличие каких-либо включений в тромбоциты.

Причины ошибок

Другие аналитические технологии

Практически все гематологические анализаторы неплохо измеряют число эритроцитов и лейкоцитов в крови, хорошие результаты точности и воспроизводимости демонстрирует метод определения концентрации гемоглобина, реализованный в таких приборах. Однако и в настоящее время еще встречаются образцы анализаторов, которые число тромбоцитов при тромбоцитопениях подсчитывают неточно, и, как правило, наблюдается завышение числа тромбоцитов при их автоматизированном подсчете. Особенно ярко этот недостаток проявляется при работе с образцами крови, в которых число тромбоцитов ниже 50 х 109/л. Этот недостаток есть следствие того, что тромбоциты гораздо мельче других клеток крови, поэтому сложнее выполнить их корректный подсчет в той же камере и такими же техническими приемами, что и другие клетки крови. Следует отметить также, что на показатели точности подсчета тромбоцитов на гематологическом анализаторе весьма существенное влияние оказывают качество и надежность используемых калибраторов. Именно поэтому в сложных диагностических ситуациях или при глубокой тромбоцитопении в анамнезе для уточнения числа тромбоцитов следует применять микроскопический метод.

Подсчет клеток крови в окрашенных мазках имеет низкую точность и воспроизводимость, поэтому он не может быть рекомендован для применения в современных клиниках.

www.sweli.ru

Определение количества тромбоцитов в крови

Сохрани ссылку в одной из сетей:

ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОЛИЧЕСТВА ТРОМБОЦИТОВ В КРОВИ

Микроскопический метод подсчета

Чаще всего используется метод подсчета тромбоцитов в счетной камере Горяева микроскопией при фазовом контрасте, т.е. с фазово-контрастной приставкой. Мало точен и не может быть рекомендован метод подсчета тромбоцитов в мазке крови.

В настоящее время все шире используются определение количества тромбоцитов и их распределение по величине (гистограмма) с помощью автоматических счетчиков крови. Эти аппараты точны и позволяют проводить экспресс-диагностику (определения выполняются за 1 мин).

Принцип. Производится подсчет тромбоцитов в камере Горяева с применением в качестве разводящей и гемолизирующей жидкости раствора оксалата аммония. При подсчете используют фазово-контрастную микроскопию.

Реактивы. 1% раствор оксалата аммония.

Ход определения. Исследование можно проводить как в крови, полученной из пальца, так и в стабилизированной цитратом венозной крови. В последнем случае полученный при подсчете результат умножают на коэффициент 1,1 (учитывают разведение венозной крови раствором цитрата натрия - 9:1).

Разведение крови. Самым удобным и достаточно точным является способ разведения крови в пробирках (не в меланжере). Для этого, в предварительно высушенную чистую силиконированную или пластиковую (полистирол) пробирку пипеткой отмеривают 1,98 мл 1% оксалата аммония и осторожно вносят в нее 0,02 мл крови. В течение 1-2 мин содержимое пробирки тщательно перемешивают без вспенивания. Заполняют две камеры Горяева и на 10-15 мин помещают их для оседания тромбоцитов во влажную камеру (чашку Петри со смоченной фильтровальной бумагой или марлей). В каждой камере подсчитывают тромбоциты в 25 больших квадратах.

Фазово-контрастная микроскопия проводится при помощи обычного микроскопа, осветителя типа ОИ-19 (или аналогичного) и устройства для наблюдения методом фазового контраста КФ-1 или КФ-4.

Подготовка микроскопа. После установки на микроскопе фазовых объективов и фазового конденсора производят фокусировку объективов 40х на сетке камеры Горяева. Устанавливают освещение и центрируют изображение фазовой пластинки и кольцевой диафрагмы. Микроскопию проводят с зеленым светофильтром. При работе с фазово-контрастной установкой необходимо пользоваться камерами одного типа, так как фокусировка оптических систем зависит от толщины стекла камеры.

Расчет определения числа тромбоцитов в 1 мкл крови. Среднюю арифметическую величину из двух параллельных определений умножают на 1000 (площадь 25 больших квадратов - 1 мм2, высота камеры - 0,1 мм, разведение 1:100; следовательно, количество тромбоцитов должно быть умножено на1 х10х100 = 1000).

Нормальные пределы колебаний числа тромбоцитов в крови у человека составляют от 170 до 350 х 109/л. Ошибка метода ± 6,5%.

Подсчет тромбоцитов в крови и определение их размера в мазке - важная часть диагностики тромбоцитопений, эссенциальной и полицитемической тромбоцитемии, ДВС-синдрома, тромботической тромбоцитопенической пурпуры и других микротромбоваскулитов, нарушений гемостаза при аутоимунных формах патологии (СКВ, антифосфолипидном синдроме и др.) и при гепатолиенальном синдроме. При наследственных тромбоцитопатиях наблюдаются формы с микроцитозом (синдром Вискотта-Олдрича) и преобладанием гигантских форм кровяных пластинок (аномалии Бернара-Сулье и Мей-Хегглина), а также формы без изменения размеров этих клеточных элементов.

Подсчет тромбоцитов на гематологическом анализаторе.

На сегодняшний день методом выбора при исследовании тромбоцитов является их определение на автоматическом анализаторе. Автоматические счетчики позволяют получать достаточно надежные результаты при определении количества тромбоцитов.

При подсчете тромбоцитов по Фонио коэффициент вариации находится в пределах 20%, в камере Горяева - составляет 7-10%, тогда как автоматический подсчет воспроизводится с точностью до 2-4%.

Современные анализаторы сигнализируют о выходе количества тромбоцитов за референтные пределы, наличии агрегатов тромбоцитов, макротромбоцитов или других элементов, сравнимых по объему с тромбоцитами (микроэритроциты), что существенно облегчает трактовку получаемых результатов.

В то же время следует иметь в виду, что в отличие от ручного подсчета тромбоцитов, где проводится предварительный лизис эритроцитов, автоматические счетчики крови анализируют тромбоциты и эритроциты в одной камере без предварительной обработки. Тромбоциты распознаются по размерам в диапазоне 2-20 фл. Это создает проблему дифференцирования больших форм тромбоцитов (макротромбоцитов) и сравнимых с ними по объему эритроцитов (микроцитов), их фрагментов (шизоцитов), а также отшнуровавшихся фрагментов цитоплазмы лейкоцитов (клеточный дебрис).

Ложное занижение числа тромбоцитов может быть при их агрегации, агглютинации под действием тромбоцитарных агглютининов и при прилипании тромбоцитов к лейкоцитам (тромбоцитарный «сателлитизм»). При подсчете на гематологических анализаторах в качестве антикоагулянта используется ЭДТА. При наличии аутоантител к тромбоцитам калиевая соль ЭДТА инициирует агрегацию тромбоцитов, что проявляется псевдотромбоцитопенией.

Нормальные величины. Количество тромбоцитов у здоровых людей составляет 170 - 350 х 109/л.

Клиническое значение

Снижение количества PLT в крови - тромбоцитопения - может развиваться в результате снижения продукции PLT:

Клинико-диагностическое значение тромбоцитопений (по С.А. Луговской и соавт., 2002)

Патогенетические механизмы

Клинические ситуациии патологические состояния

Недостаточность гемопоэза -нарушение образования тромбоцитов

Гипо-и апластические состояния, лейкозы, метастазы рака в костный мозг, ионизирующее облучение, химиотерапия, дефицит витамина В12 или фолиевои кислоты, вирусные инфекции, сепсис, милиарный туберкулез и др.

Повышенное потребление тромбоцитов

Кровопотеря, ДВС, гигантская гемангиома, тромбоз, геморрагическая тромбоцитемия.

Повышенная деструкция тромбоцитов (внутриклеточный, внутрисосудистый гемолиз)

Ауто- и иммунные гемолитические анемии, изоиммунные, гетероиммунные (гаптеновые), лекарственные, вирусные, системная красная волчанка, лимфопролиферативные заболевания, поеттрансфузионные реакции и др.

Механические повреждения тромбоцитов

Протезирование клапанов сердца, экстракорпоральное кровообращение.

Интоксикация: экзогенная, эндогенная

Химические вещества, лекарственные препараты, алкоголь, уремия, тяжелые заболевания печени.

Повышенная секвестрация в селезенке (гиперспленизм)

Спленомегалия при циррозе печени, портальной гипертензии, гистиоцитозах, болезнях накопления, болезни Гоше, синдроме Фелти, туберкулезе селезенки, миелопролиферативных заболеваниях, талассемии.

Иммунные тромбоцитопении

(по С.А. Луговской и соавт., 2002)

Заболевание

Характеристика антитромбоцитарных антител

Идиопатическая (аутоиммунная) тромбоцитарная пурпура

Аутоантитела против неизмененных антигенов тромбоцитов больного

Гаптеновая (гетероимунная) тромбоцитопения

Гаптеновые аутоантитела против измененных или чужеродных антигенов на поверхности тромбоцитов

Лекарственная тромбоцитопения

Антитела против комплекса лекарства (хинин, гепарин) с тромбоцитарным антигеном

Тромбоцитопения, ассоциированная с вирусной инфекцией

Антитела против вирусных антигенов, фиксированных на поверхности тромбоцитов, или против измененных тромбоцитарных антигенов

Аллоиммунная тромбоцитопения

Аллоантитела против аллоантигенов тромбоцитов плода или переливаемых тромбоцитов

Неонатальная аллоиммунная тромбоцитопеническая пурпура

Аллоантитела матери, проникшие в организм плода. Направлены против аллоантигенов тромбоцитов плода и отца, отсутствующих на тромбоцитах матери

Повышение количества PLT в крови - тромбоцитоз - характерно для миелопролиферативных заболеваний. Тромбоцитоз наблюдается также при злокачественных новообразованиях, после операций, при воспалительных заболеваниях (острый ревматизм, ревматоидный артрит, туберкулез, остеомиелит), после спленэктомии, циррозе печени, кровотечениях, в период выздоровления при мегалобластных анемиях, лечении кортикостероидами, остром гемолизе, физических перенапряжениях.

Тромбоцитозы

Тромбоцитоз

Заболевания и синдромы

Реактивный

Спленэктомия, острая кровопотеря, острый гемолиз, состояние после операции, злокачественные новообразования, ревматоидный артрит, туберкулез, язвенный колит, остеомиелит

Опухолевый

Миелопролиферативные заболевания (хронический миелолейкоз, идиопатический миелофиброз, эритремия, хронический мегакариоцитарный лейкоз), острый мегакариобластный лейкоз, идиопатическая геморрагическая тромбоцитемия

Средний объем тромбоцита (МРV)

У здоровых людей MPV равен 6-12 фл и находится в обратной зависимости от числа тромбоцитов. MPV увеличивается с возрастом. У мужчин MPV несколько выше, чем у женщин.

Использование ЭДТА в качестве антикоагулянта вызывает изменение формы тромбоцитов от диска к сфере, что приводит к увеличению MPV на 10-12% в течение 2 часов, а затем показатель существенно не меняется. Под действием цитрата натрия MPV может уменьшаться или увеличиваться, а при высокой концентрации (1:4) - не изменяется со временем. Кроме типа применяемого антикоагулянта и времени от момента взятия пробы до исследования, на MPV оказывает влияние температура окружающей среды. Преходящее увеличение MPV отмечается у рабочих, контактирующих с асфальтовыми испарениями, органическими растворителями. MPV - важный диагностический показатель функции тромбоцитов.

PDW - показатель, являющийся мерой гетерогенности размеров (анизоцитоза) тромбоцитов. Величина PDW в среднем составляет 10-15%.

Как артефакт, ложно завышенное увеличение PDW может быть связано с присутствием микроцитов, шизоцитов, микроагрегатов тромбоцитов, фрагментов цитоплазмы лейкоцитов.

Этот показатель находится в обратной зависимости от числа тромбоцитов и их периода жизни. В каждом конкретном случае важна не только величина PDW, но и ее динамика во времени, а также связь с другими тромбоцитарными показателями. Так, увеличение PDW с одновременным снижением MPV свидетельствует о преобладании микротромбоцитов среди общей популяции тромбоцитов (указывает на угнетение тромбоцитопоэза), а сочетание повышенного PDW с увеличением MPV отражает нарастание числа макротромбоцитов (усиление продукции тромбоцитов). Одновременное присутствие фракций макротромбоцитов и микротромбоцитов ведет к увеличению PDW, но MPV может оставаться в пределах нормы. В современных гематологических анализаторах отдельными показателями указывается процентное содержание микротромбоцитов (MicroPLT) и макротромбоцитов (MacroPLT).

PDW может применяться для дифференциальной диагностики. Так, увеличение PDW свыше 15% было обнаружено у 50% больных эссенциальной тромбоцитемией, у 21% пациентов с реактивным тромбоцитозом и лишь у 14% здоровых людей.

РСТ - показатель, характеризующий процент тромбоцитарной массы в объеме крови: вычисляется суммированием прямо измеренных объемов тромбоцитов или произведением среднего объема тромбоцитов на их число.

У здорового человека показатель стремится остаться стабильным: при уменьшении числа тромбоцитов усиливается тромбопоэз, в циркулирующую кровь выбрасывается большее число молодых макротромбоцитов, что ведет к увеличению MPV. При увеличении количества циркулирующих тромбоцитов снижается продукция их в костном мозге, тем самым уменьшается процент макротромбоцитов и MPV уменьшается. Однако при нарушении этого равновесия происходит или уменьшение РСТ, что, в конечном счете, приводит к патологии первичного гемостаза и риску возникновения кровотечений, или повышение РСТ, увеличивающее активность тромбоцитов и их способность к агрегации. Это повышает риск тромбозов.

Нормальные значения РСТ варьируют в пределах 0,15-0,35%. Было обнаружено, что снижение РСТ менее 0,1% обусловило возникновение послеоперационных кровотечений у пациентов с развившейся тромбоцитопенией. Также было отмечено, что этот показатель оказался более чувствительным для оценки риска возникновения кровотечения, чем число тромбоцитов.

Если скрининговые методы указывают на нарушение функции тромбоцитов, необходимо выполнить специальные тесты с учетом диеты и лекарственных препаратов, принимаемых пациентом (отмена за 7-10 суток перед исследованием глюкокортикостероидов, аспирина и других нестероидных противовоспалительных средств, адреноблокаторов, блокаторов кальциевых каналов, антиагрегантов: пентоксифиллина, папаверина, теофиллина, дипиридамола, тиклопидина, антибиотиков - пенициллина, карбенициллина).

Методы определения длительности кровотечения

Длительность кровотечения является скрининговым тестом для выявления нарушений первичного гемостаза. Метод основан на определении времени кровотечения из нанесенной на поверхности кожных покровов небольшой ранки стандартного размера. Это время зависит от способности сосудисто-тромбоцитарных гемостатических механизмов останавливать кровотечение из поврежденных мелких сосудов и капиллляров и поэтому его продолжительность может характеризовать состояние первичного гемостаза. Оно может быть нарушено вследствие дефектов сосудистого звена, неполноценности функциональных свойств кровяных пластинок или дефицита/дефекта плазменных кофакторов тромбоцитарных реакций (фибриногена, фактора Виллебранда), выраженной тромбоцитопении. При снижении числа тромбоцитов менее 100x109/л имеется прямая связь между степенью тромбоцитопении и удлинением времени кровотечения. Длительность кровотечения коррелирует также с геморрагическими тенденциями при тромбоцитопатиях и болезни Виллебранда. Увеличение времени кровотечения наблюдается и при тяжелой анемии (Ht

Помимо решения диагностических задач тест рекомендуется проводить для контроля за эффективностью применяемой гемостатической терапии, для своевременного выявления угрозы геморрагических осложнений при проведении дезагрегационной терапии. Длительность кровотечения должна быть определена у больного в период предоперационной подготовки, т.к. значительная часть больных с патологией тромбоцитарного звена гемостаза имеет скрытую форму заболевания, которая тем не менее дает тяжелые кровотечения в ходе операции и после нее.

В настоящее время используют в основном два принципа при определении длительности кровотечения; проведение теста в условиях, не затрудняющих течение первичного гемостаза, и в условиях, препятствующих его осуществлению.

К первым методам относится тест Duke, при выполнении которого колотую ранку глубиной 3,5 мм наносят скарификатором в нижней части мочки уха; выступающие капли крови осторожно, не прикасаясь к раневой поверхности, снимают фильтровальной бумагой через 15-30 с. Регистрируют время от момента нанесения укола до прекращения кровотечения, которое в норме не превышает 4 мин. Тест малочувствителен и не позволяет выявить нарушения при тромбоцитопатиях легкой и средней тяжести.

Наиболее распространенными за рубежом методами определения длительности кровотечения второй группы являются различные модификации метода Ivy, который предложил проводить исследование на верхней конечности в условиях веностаза, затрудняющего сосудистые реакции.

Определение длительности кровотечения по методу Айви

Принцип метода

Оценивают длительность кровотечения после разреза кожи предплечья скарификатором с глубиной разреза 3 мм. Стандартизация метода достигается равной глубиной кожного разреза и созданием венозного стаза путем повышения венозного давления до 40 мм рт. ст. при помощи сфигмома-нометра, что предупреждает эффект преждевременного склеивания краев раны.

Реактивы и оборудование

70% раствор этанола.

Сфигмоманометр.

Скарификатор, способный осуществить разрез кожи глубиной 2-3 мм.

Ход выполнения

Сфигмоманометр накладывают на плечо, нагнетают в нем давление, равное 40 мм рт. ст., и поддерживают такое давление в течение всего исследования.

Ладонную поверхность предплечья обрабатывают раствором этанола.

Натягивают кожу предплечья в поперечном (по отношению к костям предплечья) направлении.

Скарификатором наносят три разреза кожи по 5—10 мм (направление разреза должно быть перпендикулярно натяжению кожи предплечья, т. е. параллельно костям предплечья) глубиной 3 мм и включают секундомер.

Капли крови осторожно удаляют фильтровальной бумагой путем ее смачивания через каждые 15-30 с.

Регистрируют время остановки кровотечения из каждой ранки.

Снижают давление в манжете сфигмоманометра.

Вычисляют средний результат длительности кровотечения для каждого из трех разрезов.

Оценка результатов исследования

Существует несколько схожих методов для оценки длительности кровотечения [WW Duke, 1910; C.F. Borchgrevink, B.A. Waaler, 1958], однако метод Айви отличается от аналогичных неплохой воспроизводимостью и малой травматичностью. В оригинальном исполнении нормальное время кровотечения не превышает 8 мин, однако указанный норматив условен, поскольку результаты определения длительности кровотечения этим методом значимо варьируют в зависимости от варианта скарификатора и опыта исследователя, поэтому необходимо уточнить нормативы для каждой лаборатории. При тромбоцитопениях, тромбоцитопатиях и болезни Виллебранда длительность кровотечения часто удлинена, а при изолированных дефектах коагуляцион-ного гемостаза (гемофилии и др.) длительность кровотечения не отличается от нормы.

Причины ошибок

Нестандартный скарификатор, неглубокий (менее 3 мм) разрез кожи, недостаточная квалификация лаборанта.

Исследование агрегационной функции тромбоцитов

Принцип метода

Тромбоциты способны агрегировать под воздействием различных субстанций, называемых индукторами (стимуляторами) агрегации (АДФ, адреналин, арахидоновая кислота, тромбин, кальциевый ионофор А23187, коллаген, фибрин-мономер, бычий коагуляционный фактор VIII, ристоцетин и др.). Изучение агрегационной функции тромбоцитов осуществляют при помощи специального прибора - агрегометра. В основе записи агре-гатограммы этим прибором — принцип Борна, который предполагает графическую регистрацию выраженности уменьшения оптической плотности богатой тромбоцитами плазмы в процессе агрегации тромбоцитов. В случае нарушения агрегационной функции тромбоцитов происходит незначительное изменение оптической плотности, что и регистрирует этот прибор.

Забор крови и подготовка плазмы для исследования

После пункции локтевой вены самотеком кровью наполняют пластиковую или силиконированную пробирку, в которую предварительно добавлен раствор цитрата натрия (соотношение объемов крови и цитрата натрия равно 9:1). Затем пробирку тщательно и аккуратно (без встряхивания) перемешивают в течение 2-3 минут.

Материалом для исследования является бедная тромбоцитами плазма.

БТП получают в два этапа. На первом этапе получают богатую тромбоцитами плазму, для чего цитратную кровь центрифугируют в течение 7 минут при 240 g. На втором этапе богатую тромбоцитами плазму переносят в другую пробирку и повторно центрифугируют в течение 15 минут при 1200-1400 g.

Реактивы и оборудование

0,11 М раствор цитрата натрия (Na3C6H607).

Агрегометр с компьютером и принтером.

Стимуляторы агрегации (АДФ, адреналин, коллаген и др.). В табл. 12 представлены оптимальные конечные концентрации наиболее распространенных стимуляторов агрегации тромбоцитов.

Таблица. Оптимальные конечные концентрации стимуляторов агрегации тромбоцитов

Индукторы тромбоцитарной агрегации

Конечные концентрации индукторов

АДФ

5-10µМ

Адреналин

10µМ

Коллаген

2-5 ug/ml

Арахидоновая кислота

0,5 mM

Ристоцетин

1,25-1,50 mg/ml

Ристоцетин для диагностики 2В типа болезни Виллебранда

0,25 mg/ml

Для проведения анализа предварительно необходимо подсчитать число тромбоцитов на гематологическом анализаторе или микроскопическим методом.

Ход определения

Материалом для исследования является богатая тромбоцитами плазма, но для калибровки прибора необходима еще и бедная тромбоцитами плазма.

Поскольку при разном числе тромбоцитов необходимы разные концентрации индукторов агрегации, следует приготовить богатую плазму с одинаковым числом тромбоцитов для всех образцов (исследуемых и контрольных). Для стандартизации числа тромбоцитов следует развести богатую тромбоцитами плазму бедной таким образом, чтобы число тромбоцитов стало равным 150-300 х 109. Например, число тромбоцитов 600 х 109, поэтому исследуемую богатую тромбоцитами плазму необходимо развести бедной тромбоцитами плазмой этого же больного в 2 раза. Таким образом, на первом этапе исследования очень важно определить число тромбоцитов.

Для записи агрегатограммы любому агрегометру необходимо определить оптическую плотность и ряд других параметров в исследуемых образцах, поэтому компьютерный алгоритм агрегометра будет требовать установить в измерительные гнезда пробирки с бедной и богатой тромбоцитами плазмами.

В кювету агрегометра вносят 0,3 мл богатой тромбоцитами плазмы (со стандартным числом тромбоцитов 150—300 х 109), инкубируют пробирку в гнезде для измерения в течение 60—120 с для нагрева богатой тромбоцитами плазмы до 37 °С, затем включают магнитную мешалку, добавляют 0,015 мл раствора индуктора агрегации. В момент добавления индуктора агрегации включают запись регистрации агрегации*.

Оценка результатов исследования

Существует много способов оценки агрегатограмм, но наиболее информативно измерение степени агрегации и угла наклона, поскольку неплохую воспроизводимость демонстрируют именно эти показатели. Их нормальный диапазон зависит от большого числа причин (марки агрегометра, используемых реагентов, числа тромбоцитов, конечной концентрации индуктора, скорости вращения магнитной мешалки и многих других), поэтому общепринятых диапазонов нормы при измерении агрегационной функции тромбоцитов нет. Это вынуждает врачей-лаборантов уточнять нормативы самостоятельно.

Применение низких концентраций стимуляторов агрегации дает возможность оценить раздельно первую и вторую волны агрегации. Большую ценность имеет информация о наличии или отсутствии второй волны агрегации, поскольку именно вторая волна на агрегатограмме отражает реакцию высвобождения содержимого тромбоцитарных гранул (плотных и а-гранул). Весьма полезно при записи агрегации тромбоцитов использовать несколько стимуляторов агрегации. При наличии геморрагического синдрома и отсутствии нарушений агрегации тромбоцитов необходимо повторно выполнить исследование через 1—1,5 месяца. И наоборот, при наличии специфичных изменений агрегации для болезни Бернара-Сулье, тромбастении Гланцманна и другой патологии необходимо повторно исследовать агрегационную функцию тромбоцитов.

Причины ошибок

Тест очень чувствителен к дефектам преаналитического этапа. Даже минимальный недостаток цитрата натрия вследствие низкого гематокрита ведет к значительным погрешностям и невоспроизводимым результатам.

Последовательность манипуляций и объемы смешиваемых реагентов могут отличаться для разных типов агрегометров.

Для исследования агрегации необходимо использовать специальные иглы для пункции кубитальной вены, которые способны наполнить кровью пробирки с цитратом натрия самотеком. Забирать кровь шприцом нельзя.

Некачественная обработка магнитных мешалок и пробирок ведет к грубым ошибкам. Существенную помощь в обработке лабораторной посуды оказывают ультразвуковые мойки.

Неточный замер прибором оптической плотности богатой и бедной тромбоцитами плазмы также приводит к ошибкам. Подобный дефект возможен при наличии царапин на пробирках.

Неточное определение числа тромбоцитов и, как следствие, исследование образца плазмы с нестандартным числом тромбоцитов является причиной ошибок.

Варианты результатов записи агрегации тромбоцитов методом Борна при различных вариантах нарушений сосудисто-тромбоцитарного гемостаза.

Патология гемостаза

АДФ

Арахи-доновая кислота

Коллаген

Адреналин

Ристоцетин

Тромбоцитопатия

Норма или снижение*

Норма или снижение*

Норма или снижение*

Норма или снижение*

Норма

Влияние аспирина или других нестероидных противовоспалительных препаратов

Норма или снижение (часто умеренное) с нарушением второй волны

Отсутствие или значимое снижение

Норма для концентрации 5 ug/ml или снижение для концентрации 2 ug/ml

Снижение с

нарушением

формирования

второй волны

на агрегато-

грамме

Норма или умеренное снижение

Нарушение пула хранения

Норма или снижение (часто умеренное) с нарушением второй волны

Норма

Норма

Снижение с нарушением формирования второй волны на агрегато-грамме

Норма

Синдром Бернара-Сулье

Норма

Норма

Норма

Норма

Отсутствие

или значимое

снижение

Нарушение реакций высвобождения (секреции) из тромбоцитарных гранул

Норма или снижение

(часто уме­ренное) с

нарушением второй волны

Норма

Норма

Снижение с

нарушением

формирования

второй волны

на агрегато-

грамме

Норма

Тромбастения Гланцманна

Отсутствие

Отсутствие

Отсутствие

Отсутствие

Норма

Болезнь Виллебранда

Норма

Норма

Норма

Норма

Отсутствие или значимое

снижение (иногда норма при 2N, повышение при типе 2В)

*

При тромбоцитопатиях может быть нарушена агрегация с одним (обуславливая так называемую парциальную тромбоцитопатию) или разными индукторами агрегации.

Иногда диагностические трудности возникают при дифференциальной диагностике болезни Виллебранда и болезни Бернара-Сулье, поскольку варианты нарушений при исследовании агрегационной функции тромбоцитов при этих состояниях одинаковы. В этом случае помогает добавление в исследуемую богатую тромбоцитами плазму нормальной БТП или крио-преципитата. Эта простая модификация восстанавливает ристомициновую агрегацию у больных с болезнью Виллебранда, но не исправляет нарушение агрегации при болезни Бернара-Сулье.

gigabaza.ru

Резистентность (ломкость) капилляров Проба Румпель-Лееде-Кончаловского

Из методов оценки ломкости капилляров чаще всего используется манжеточная проба Румпель-Лееде-Кончаловского (рис. 712051024).

Манжету для измерения АД накладывают на плечо, создавая в ней постоянное давление, равное 100 мм рт. ст. Через 5 минут оценивают результаты пробы. При отсутствии нарушений сосудисто-тромбоцитарного гемостаза ниже манжеты появляется лишь небольшое количество петехиальных (мелкоточечных) кровоизлияний (менее 10 петехий в зоне, ограниченной окружностью диаметром 5 см). При повышении проницаемости сосудов или тромбоцитопении число петехий в этой зоне превышает 10 (положительная проба).

Метод Дьюка

Предварительно мочку уха согревают между пальцами.

Стерильным скарификатором или плоским ланцетом прокалывают нижний валик мочки уха (глубина прокола 3,5—4,0 мм) и включают секундомер.

Выступающие капли крови каждые 30 с промокают фильтровальной бумагой, не прикасаясь к ранке. Как только наступит момент, когда новые капли крови не образуются, выключают секундомер и определяют общую длительность кровотечения, а также оценивают размеры капель (рис. 712051042).

Рис. 712051042. Определение времени кровотечения по Дьюку (а) у здорового человека (время кровотечения 3,5 мин.) и (б) у больного с выраженной тромбоцитопенией (время кровотечения 20 мин.)

Запомните

В норме время кровотечения по Дьюку не превышает 4 мин. Его увеличение наблюдается при выраженных тромбоцитопениях или/и тяжелых нарушениях их функции (тромбоцитопатиях).

Следует помнить также, что у 60 % больных с этой патологией тест оказывается отрицательным, и время кровотечения нормально.

Метод Айви

Несколько более чувствительным является тест Айви, когда оценивают время кровотечения из надрезов на коже ладонной поверхности верхней трети предплечья на фоне искусственного повышения венозного давления с помощью манжеты для определения АД, в которой поддерживают давление 40 мм рт. ст. (рис. 1.87).

В норме время кровотечения по Айви не превышает 8 минут.

Подсчет числа тромбоцитов

Наибольшее распространение в настоящее время получили три метода подсчета тромбоцитов в крови:

  1. Подсчет в камере Горяева;

  2. Подсчет в мазках крови;

  3. Электронно-автоматический метод.

Подсчет в камере Горяева

Метод подсчета тромбоцитов в камере Горяева является самым точным, но достаточно трудоемким.

Подсчет тромбоцитов в 1 л проводится по стандартной методике с учетом разведения крови и объема большого квадрата счетной сетки Горяева с применением фазово-контрастного микроскопа для лучшего контрастирования тромбоцитов.

Заполняют камеру Горяева и подсчитывают тромбоциты в 25 больших квадратах. Практически для расчета количества тромбоцитов в 1 л крови число сосчитанных в 25 больших квадратах кровяных пластинах умножают на 2х106.

Метод подсчета тромбоцитов в окрашенных мазках крови

Метод подсчета тромбоцитов в окрашенных мазках кровиоснован на подсчете числа тромбоцитов на 1000 эритроцитов с последующим пересчетом на 1 л крови.

Зная число эритроцитов в 1 л крови, рассчитывают количество тромбоцитов в этом объеме.

studfiles.net


Смотрите также