Приготовление мазка крови


Приготовление, фиксация и окраска мазков крови

Окраска мазков.

Краску следует готовить на воде нейтральной реакции.

Окраска мазков.

Принцип.

Все предложенные методы окраски мазков основаны главным образом на химическом сродстве основных частей клеток к определенным анилиновым краскам и в меньшей степени на их физических свойствах. Цитоплазма одних клеток, будучи щелочной, имеет сродство к кислым краскам, выявляя оксифильные элементы крови. Цитоплазма других клеток, содержащих базофильные и нейтрофильные субстанции, поглощает и кислые, и основные краски. Ядра, содержащие в значительном количестве нуклеиновую кислоту, связывают главным образом основные краски.

К основным гематологическим краскам относятся метиленовый синий и его производные— азур I (метиленазур) и азур II (смесь равных частей азура I и метиленового синего),

к кислым — водорастворимый желтый эозин.

Азур-эозиновые смеси красок обладают высокой чувствительностью к реакции воды и поэтому применяемая для приготовления красителей и для смывания их дистиллированная вода должна иметь нейтральную реакцию, т. е. рН 7,0. При кислей реакции воды клетки долго не прокрашиваются и имеют красный оттенок. При щелочной реакции эритроциты окрашиваются в серовато-синий цвет, а ядра и цитоплазма клеток — в очень темные цвета.

Определение рН воды.

Концентрацию водородных ионов (рН) воды определяют с помощью рН-метра, или индикаторных бумажек.

Нейтрализация дистиллированной воды.

Кислую воду подщелачивают по каплям 1% раствором карбоната натрия,

щелочную — подкисляют 1% раствором уксусной кислоты до тех пор, пока она не будет иметь рН 7,0.

Более удобен способ нейтрализации буферными смесями.

Для этого готовят 1/15 н. растворы:

1) динатрийфосфата (Na2HPO4*2Н20), высушенного в теплом месте в течение 5 сут, растворением 11,876 г его в 1 л дистиллированной воды

2) монофосфата калия (КН2РО4) растворением 9,078 г его в 1 л дистиллированной воды. Эти растворы хранят в темном месте с прибавлением кристаллика тимола для предотвращения образования плесени.

Пользоваться ими можно до образования в них хлопьев.

Рабочую смесь готовят смешиванием 7 частей первого раствора с 3 частями второго.

Пример.

Определяют рН дистиллированной воды, подлежащей нейтрализации. Допустим, что рН воды 5,2, тогда к 100 мл дистиллированной воды прибавляют 4,5—5 мл указанной выше буферной смеси, перемешивают и вновь определяют рН. Если рН будет 6,8—7,0, т. е. требуемая, то, исходя из этого, высчитывают по простому тройному правилу количество буферного раствора, которое необходимо добавить ко всему количеству дистиллированной воды, подлежащей нейтрализации.

Окраска по Романовскому

Принцип.

Окрашивание различных элементов клеток в разные цвета и оттенки смесью основных (азур II) и кислых (водорастворимый желтый эозин) красок.

Посуда и аппаратура.

1. Колба или бутыль емкостью 1 л.

2. Измерительные цилиндры емкостью 250 мл.

3. Цилиндры для разведения красок емкостью 100 мл.

4. Градуированная пипетка.

5. Штатив для мазков.

6. Кювета со стеклянным мостиком для окраски.

Реактивы.

В продаже имеется готовый раствор краски Романовского, а также сухая краска Романовского (Гимзы), из которой приготовляют раствор следующим образом: 3,8 г сухой краски Романовского растворяют в 250 мл чи­стого метилового или этилового спирта (последний хуже).

Раствор оставляют на 3—5 сут, часто взбалтывая для лучшего растворения краски.

Затем прибавляют 250 мл чистого глицерина и вновь оставляют на 3—5 сут, периодически взбалтывая. Приготовленная таким образом краска хорошо сохраняется длительное время в темных бутылях в шкафу, где нет ни кислот, ни щелочей.

Вновь полученный или приготовленный раствор красителя Романовского перед употреблением оттитровывают, т. е. окрашивают несколько фиксированных мазков крови в течение 25—40 мин различно разведенной краской (1—2 капли краски на 1 мл дистиллированной воды). По хорошо окрашенному препарату устанавливают  нужное количество капель краски на 1 мл воды и время окрашивания.

Методика.

Фиксированные мазки укладывают на мостик, состоящий из двух стеклянных палочек, уложенных на два противоположных края кюветы.

Затем мазки заливают разведенной краской, которую наливают на мазок возможно более высоким слоем. Окрашивание длится в зависимости от температуры воздуха в помещении от 25 до 45 мин.

Если температура в помещении низкая или требуется быстрее окрасить мазки, то разведенную краску можно подогреть до 60—70° (до кипения доводить нельзя).

После окончания окраски краску смывают (но не сливают) сильной струей воды и ставят мазки вертикально в деревянный штатив для просушивания.

Разведенной краской можно пользоваться только в течение одного дня.

Окраска по Романовскому в модификации Филипсона.

Принцип.

Применение красителей-фиксаторов, которыми мазки крови в первый период одновременно фиксируются и частично окрашиваются, а во второй период, после разбавления красителей -фиксаторов дистиллированной водой, докрашиваются окончательно.

Посуда и аппаратура — см. «Окраска по Романовскому».

Реактивы.

1.Одну часть готовой краски Романовского и 3 части этилового спирта (ректификата) тщательно смешивают. Краска сразу же пригодна к употреблению, но можно готовить ее и заранее.

2. Дистиллированная вода нейтральной реакции.

Методика.

Приготовленный краситель наливают на нефиксированный мазок, покрывая его полностью и

через 1 — 1мин30 сек, не сливая красителя, прибавляют к нему но каплям примерно столько же дистиллированной воды, следя за тем, чтобы вода при соединении с красителем не сливалась с мазка. Через 20—30 мин краситель смывают водой и мазок высушивают.

Этим способом клетки окрашиваются хорошо, но иногда, по-видимому, от недоброкачественности спирта в эритроцитах обнаруживаются мелкие пузырьки, мешающие определению степени насыщения их гемоглобином.

Окраска по Лейшману.

Способ Лейшмана отличается от предыдущего лишь применяемым красителем и продолжительностью периодов фиксации и окраски. При этом способе применяют краситель, получаемый растворением смеси азура I, метиленового синего и желтого водорастворимого эозина в количестве 0,2 г в 10 мл абсолютного метилового спирта.

Продолжительность фиксации неразбавленным красителем 3—4 мин, а окраски с равным количеством воды 5—10 мин.

Способы быстрой окраски мазков краской Романовского по Алексееву.

Принцип.

Одновременная фиксация и окраска мазков с применением для ускорения окрашивания по первому способу подогрева дистиллированной воды и по второму способу — подогрева разведенной краски Романовского.

Посуда и аппаратура.

1. Глазные пипетки.

2. Водяная баня.

3. Темная бутыль с притертой пробкой емкостью 1 л. Остальное — см. «Окраска по Романовскому».

Реактивы.

1. Разведенная краска Романовского (1,5 капли краски на 1 мл дистиллированной воды).

2. Краситель Лейшмана для второго метода (растворяют 4 г сухой краски в 1 л метилового спирта и хранят в темной посуде).

3. Чистый метиловый спирт.

4. Нейтральная дистиллированная вода.

5. Фильтровальная бумага.

Методика.

1. На сухой нефиксированный мазок наносят глазной пипеткой 6—10 капель краски Романовского, распределяя ее той же пипеткой равномерным слоем. Через 30 с другой пипеткой добавляют к краске по каплям удвоенное количество подогретой до 50—60° дистиллированной воды. Покачиванием препарата перемешивают краску с водой и оставляют на 3 мин в покое, затем смывают ее дистиллированной водой и высушивают мазок фильтровальной бумагой. При этом методе окраски частично гемолизируются эритроциты, однако клетки белой крови не изменяются.

При втором способе, приводимом ниже, результаты получаются лучшей окраска препаратов мало отличается от обычной окраски по Романовскому.

2. На сукой нефиксированный мазок наливают равномерным слоем 10—12 ка­пель краски Лейшмана. Через 20—30 с, не сливая краску, добавляют к ней нагретый до 50—60° раствор краски Романовского в количестве, способном удержаться на препарате. Через 3 мин, не сливая краску, смывают ее сильной струей дистиллированной воды и высушивают препарат фильтровальной бумагой.

Окраска по Нохту.

Принцип.

Воздействие на фиксированный мазок водного раствора смеси основной (азур II) и кислой краски (эозин).

Посуда и аппаратура —

см. «Окраска по Романовскому».

Реактивы.

1. Раствор 1 г азура II в 1 л дистиллированной воды.

2. Раствор 1 г водорастворимого желтого эозина в 1 л дистиллированной воды.

Каждый из этих растворов хорошо перемешивают и оставляют созревать при ежедневном встряхивании на 10—14 дней.

Перед окрашиванием раствор красителя готовят смешиванием 25 мл раствора 1,

20 мл раствора 2 с 55 мл нейтральной дистиллированной воды (пропорции вновь приготовленных растворов иногда приходится подбирать эмпирически).

Методика.

Краситель наливают на фиксированный мазок, и окрашивание длится в зависимости от температуры воздуха 25—45 мин. Затем краситель смывают и мазки высушивают на воздухе.

Окраска по Паппенгейму — Крюкову.

Принцип.

Комбинированная окраска фиксатором-красителем Мая—Грюнвальда и краской Романовского, дающая возможность очень хорошо дифференцировать составные части клеток.

Посуда и аппаратура — см. «Окраска по Романовскому».

Реактивы

1. Готовый краситель-фиксатор Мая—Грюнвальда, состоящий из эозин метиленового синего в метиловом спирте.

2. Свежеприготовленный раствор краски Романовского

(1—2 капли краски на 1 мл дистиллированной воды).

3. Нейтральная дистиллированная вода.

При отсутствии готового красителя-фиксатора Мая-Грюнвальда его можно приготовить растворением 0,3-0,5 г сухой краски Мая-Грюнвальда в 100 мл чистого метилового спирта с добавлением (или без него) 50 мл чистого глицерина.

Краситель в обоих случаях созревает 4 дня при комнатной температуре.

Методика.

На нефиксированный мазок наливают пипеткой 10—15 капель готового красителя-фиксатора Мая—Грюнвальда, через 3 мин прибавляют по каплям столько же воды и продолжают окрашивание еще 1 мин, после чего краситель смывают водой и мазок высушивают на воздухе.

Затем на высушенный мазок наливают свежеприготовленный водный раствор красителя Романовского на 8—15 мин в зависимости от температуры в помещении, смывают краску водой и мазок высушивают на воздухе. Этот способ окраски является наилучшим.

labx.narod.ru

Приготовление мазков крови

Подготовка и обработка стекол. Новые чистые стекла могут использоваться после обезжиривания в смеси Никифорова (равные части 96% этилового спирта и эфира). Использованные стекла замачиваются в течение суток в теплом мыльном растворе или растворе стирального порошка (1 столовая ложка порошка на 5 л воды). Через сутки раствор сливают, стекла промывают проточной водой. Затем их снова заливают теплым мыльным раствором или раствором стирального порошка и доводят до кипения, кипятят в этом же растворе 5—10 мин (не более, во избежание помутнения стекол). После охлаждения раствора его снова сливают, прополаскивают стекла проточной водой и каждое стекло промывают щеткой под проточной водой. Обработанные таким образом стекла раскладывают на чистой простыне для высыхания. Чистые стекла для обезжиривания помещают в смесь Никифорова или 96% этиловый спирт на 60 мин, затем вытирают насухо и хранят в чистой посуде с широким горлом. Чистые стекла рекомендуется брать либо пинцетом, либо руками за боковые края.

Приготовление мазков. На сухое подготовленное предметное стекло ближе к короткой стороне наносят стеклянной палочкой (или непосредственно из места укола пальца) небольшую каплю крови. Оставляют стекло в горизонтальном положении и размазывают кровь по стеклу с помощью сухого чистого шлифованного стекла, держа его под углом 45°. Коротким ребром, подождав, пока вся кровь не расплывется по нему, быстро проводят по предметному стеклу. Сильно нажимать на предметное стекло не следует, так как это может привести к повреждению форменных элементов крови. Мазки высушивают на воздухе и маркируют (лучше простым карандашом). Высохший мазок должен быть равномерно тонким, желтоватого цвета, достаточной величины, располагаться на расстоянии 1,0—1,5 см от краев стекла, занимать почти всю длину стекла и заканчиваться «метелочкой». Толстые (густо-розового цвета) мазки использовать не следует, так как в них морфология клеток трудноразличима.

Стандартные качественные мазки получаются при использовании автоматических устройств, предназначенных для приготовления мазков и выпускаемых различными фирмами.

Фиксация и окраска мазков крови. Перед окраской мазки крови обычно фиксируют 5–10 мин в метиловом спирте для предотвращения гемолиза, который может произойти при контакте с водой в процессе окрашивания водорастворимой краской или при последующем контакте с водой. Методики фиксации описаны ниже вместе с методиками окраски. Для окраски по Райту и Лейшману фиксация не требуется, так как эти краски содержат метиловый спирт.

Сухие мазки могут храниться в течение 2 дней в сухом теплом месте, в жаркой влажной атмосфере без фиксации они хранятся значительно меньше.

Клетки крови содержат базофильные и ацидофильные структуры, различающиеся по реакции (pH). Ядра являются базофильными и окрашиваются в голубой цвет. Высоко базофильные (кислые) гранулы базофила также синие. Гемоглобин (будучи основным) окрашивается ацидофильно, т. е. в красный цвет. Окраска с помощью комбинации кислых и основных красителей называется окраской по Романовскому и имеет различные модификации (Паппенгейма, Райта, Нохта, Лейшмана, Гимзы, Джейнера и др.). В качестве основного красителя, как правило, используется метиленовый синий, но также применяется и толуидиновый синий. В качестве кислого красителя используются эозин, азур I и азур II.

Критерии хорошей окраски: розовый цвет эритроцитов, фиолетовое окрашивание зернистости нейтрофилов на розовом фоне, нежная азурофильная зернистость моноцитов.

Для разведения краски лучше всего использовать нейтральную свежую дистиллированную воду. Несвежая дистиллированная вода становится кислой из-за захвата углекислого газа из атмосферы. Если дистиллированная вода имеет щелочную реакцию, эритроциты окрашиваются в грязный голубовато-зеленый цвет; та часть лейкоцитов, которая должна окрашиваться голубым цветом, приобретает фиолетовый оттенок, гранулы эозинофилов становятся голубоватыми и зеленоватыми вместо розовых, а гранулы нейтрофилов перекрашиваются. При кислой воде эритроциты окрашиваются в ярко-оранжевый цвет, а ядра лейкоцитов очень бледные. Идеальной является дистиллированная вода с pH 7,0, для сохранения которой применяется ее забуферивание. Можно использовать готовые к употреблению буферные таблетки, растворяемые в дистиллированной воде.

Для окраски мазков костного мозга идеальной является краска с pH 7,4–7,5.

В качестве унифицированных приняты методики окраски по Нохту и Паппенгейму.

Реактивы для фиксации: 1) метиловый спирт или 2) раствор эозин-метиленового синего по Маю-Грюнвальду.

Реактивы для окраски мазков по Нохту: 1) основной раствор азура И: 1 г краски растворяют в 1 л дистиллированной воды, оставляют в посуде из темного стекла на 12—14 дней при комнатной температуре, после чего используют; 2) основной раствор эозина калия: 1 г краски растворяют в 1 л дистиллированной воды, оставляют в посуде из темного стекла на 12—14 дней при комнатной температуре, после чего используют; 3) фосфатный буфер (смесь Вейзе), pH 7,4—7,5: смешивают 0,49 г дигидрофосфата калия (Kh3PO4) и 0,909 г гидрофосфата натрия (Na2HPO4) и растворяют в 1 л дистиллированной воды; 4) рабочий раствор азур-эозина: перед употреблением смешивают 25 мл основного раствора азура II, 20 мл основного раствора эозина калия и 55 мл буферного раствора (пропорции красителей могут варьировать, их устанавливают опытным путем при приготовлении свежих партий основных растворов).

Реактивы для окраски мазков по Паппенгейму: 1) раствор эозин-метиленового синего по Маю-Грюнвальду. При отсутствии готового раствора красителя его готовят растворением 1 г сухой краски в 1 л метилового спирта; 2) рабочий раствор азур-эозина по Нохту.

Фиксация мазков. Фиксирующий раствор наливают в кювету либо в широкогорлую посуду с притертой пробкой. Мазки помещают в контейнер, который погружают в кювету или кладут по одному в посуду на 5–10 мин. Контейнер со стеклами вынимают из фиксирующего раствора (или вынимают пинцетом стекла и устанавливают их в штативе) и оставляют на воздухе до полного высыхания.

Окраска по Нохту. Высохшие фиксированные мазки, не вынимая из контейнера, помещают в кювету с рабочим раствором краски на строго определенное время (20–45 мин), которое подбирают опытным путем для каждой партии краски. При отсутствии кюветы с контейнером стекла помещают горизонтально на параллельно положенные две стеклянные палочки («рельсы») мазком кверху и наливают на них по 3–4 мл рабочего раствора краски. Вынимают контейнер со стеклами из кюветы с красителем и помещают в кювету с водопроводной водой (при отсутствии контейнеров краску со стекол смывают водой, не снимая их со стеклянных палочек). Мазки высушивают на воздухе.

Окраска по Паппенгейму. Сухие нефиксированные мазки крови помещают в контейнер и опускают в кювету с раствором Мая—Грюнвальда на 3-5 мин (или на нефиксированный мазок наливают пипеткой 3—4 мл красителя). Контейнер с мазками ополаскивают в кювете с дистиллированной водой, а затем помещают в кювету с азур-эозиновой краской по Нохту на 8–15 мин. На стекла, помещенные на «рельсы», не сливая краситель, добавляют на 1 мин дистиллированную воду, а затем на 8–15 мин наливают на мазок краску, затем краску смывают водой. Мазки высушивают на воздухе.

Окраска по Романовскому—Гимзе. Производится так же, как по Нохту. В качестве красителя используют готовый раствор Романовского—Гимзы, который перед употреблением разводят из расчета 1 капля краски на 1 мл дистиллированной воды. Время окраски устанавливают опытным путем для каждой партии красителя (25–40 мин).

Окраска по Райту. Реактивы. 0,2 г краски Райта (сухой порошок, BDH/E. Merck) растворяют в 100 мл метилового спирта и дают постоять несколько дней. Если эритроциты окрашиваются недостаточно четко, готовят 0,25% или 0,3% раствор.

Ход окраски. На мазок наносят несколько (примерно 8) капель краски, выдерживают 2–3 мин (следят, чтобы краска не высохла), затем наливают на мазок равное количество забуференной воды. Если краска созрела, на поверхности разведенной краски появится пена или пленка с металлическим блеском. Разведенную краску оставляют на мазке на 2—3 мин, а затем смывают буферным раствором или водой. Нельзя допускать, чтобы краска осаждалась на поверхности мазка. Если это произошло, мазок заливают неразведенной краской на 15–20 с и затем еще раз буферным раствором или водой.

Приготовление фосфатного буфера.

Раствор А (0,2 М КН2PO4): 27,2 г соли растворить в 1 л дистиллированной воды.

Раствор Б (0,2 М Na2HPO4): 35,6 г Na2HPO4 × 2Н20 растворить в 1 л дистиллированной воды.

Для получения 100 мл буферного раствора с нужным pH следует слить растворы А и Б в количествах, указанных в таблице. Величину pH проверяют с помощью рН-метра.

Приготовление фосфатного буферного раствора

Раствор, мл Величина pH
6,0 6,5 7,0 7,2 7,4 7,6 8,0

А

87,9 68,7 48,8 27,4 18,2 11,5 3,1

Б

12,1 31,3 51,2 72,6 81,8 88,5 96,9

Окраска по Лейшману. Реактивы. 0,15 г сухой краски Лейшмана растворяют в 133 мл абсолютного метилового спирта. Краска должна полностью раствориться, желательно предварительно кристаллы краски растереть в ступке. Хранят краску в бутыли со стеклянной пробкой, не фильтруют.

Ход окраски. Осуществляют подобно окраске по Райту, но с двойным разведением буферного раствора. Несколько капель краски (около 8) наливают на мазок, выдерживают 2 мин. Добавляют двойное количество буферного раствора (16 капель), размешивают покачиванием и оставляют на 7–10 мин. Краску смывают дистиллированной водой за 2–3 секунды. При более длительном смывании окраска ухудшается. Мазки высушивают в штативе на воздухе.

Приготовление толстой капли крови. Три капли крови, нанесенные на предметное стекло на некотором расстоянии друг от друга, расширяют углом чистого предметного стекла до размера в диаметре примерно 1 см, маркируют карандашом, затем подсушивают на воздухе в течение 1–2 ч.

Окраска толстой капли крови. Толстые капли крови не фиксируют. Предметные стекла с хорошо просушенными толстыми каплями располагают на «рельсах» на некотором расстоянии друг от друга и на 8–10 мин наливают на них рабочий раствор азур-эозина по Нохту. Происходит «выщелачивание» эритроцитов. Затем краску сливают и на препараты наливают новую порцию рабочего раствора азур-эозина по Нохту на 30–35 мин. После этого предметные стекла осторожно ополаскивают дистиллированной водой и высушивают.

Автоматическая окраска мазков

Поскольку одной из наиболее востребованных функций в гематологической лаборатории являются приготовление и окраска мазков крови, естественны попытки их автоматизации.

Первая автоматическая система подготовки мазков была разработана компанией Sysmex (Япония) еще в 1990 г., и в настоящее время по всему миру установлено более 1600 систем. Огромный опыт, накопленный за этот период, был использован при разработке системы нового поколения — полностью автоматизированной станции подготовки и окраски мазков SP-1000i производительностью до 120 мазков в час. В SP-1000i реализуется высокая степень стандартизации и качества приготовления мазков благодаря использованию интеллектуального клинового метода, который дает возможность пользователю в зависимости от гематокрита исследуемой пробы регулировать объем наносимого образца крови, величину угла размазывающего лезвия, скорость нанесения и время ожидания, используя при этом от 8 до 16 различных уровней регулирования. Забор крови может осуществляться вручную или автоматически из открытых или закрытых пробирок.

Автоматизированная станция подготовки и окраски мазков SP-1000i компании Sysmex (Япония)

В системе используется до семи гибко настраиваемых протоколов окраски, которые позволяют стандартизировать качество окраски мазков и удовлетворить самые высокие требования. Могут быть использованы следующие протоколы двойной и одиночной окраски: по Май-Грюнвальду—Гимзе, по Романовскому и по Романовскому—Гимзе. Мазки крови окрашиваются в выделенной кассетной системе, которая содержит только один слайд на кассету. При таком способе гарантируется хорошая взаимосвязь мазка крови с окрашивающими реагентами и при этом не происходит испарения метанола из реагента в воздух. Для гарантии хорошей фиксации крови перед окраской в процесс окраски интегрирован отдельный шаг по предварительной фиксации метанола.

Благодаря гибкости протокола окраски можно использовать специальный протокол для окраски костного мозга.

onlab.info

Приготовление, фиксация и окраска мазков крови Исследование окрашенных мазков, выведение лейкограммы (лейкоцитарной формулы)

Приготовление мазков крови. Лучше мазки готовить из свежей, нативной крови. Из цитратной и оксалатной крови мазки можно приготовить до 6 ч после взятия ее, а из гепаринизированной — до 24 ч. Мазки крови готовят на предметных стеклах, которые нужно соответствую­щим образом подготовить.

Подготовка предметных стекол. Не бывшие в употреблении стекла промывают в водопро­водной воде, а затем в дистиллированной, высушивают и закладывают в банку с притертой крышкой в смесь равных количеств этилового эфира и этилового спирта. Перед работой стекла извлекают пинцетом, протирают. При необходимости, подгото­вленные таким образом стекла складывают в пакеты, за­вертывают в бумагу и закладывают на хранение в полиэ­тиленовые мешочки, которые хорошо завязывают.

Техника приготовления мазков. Пред­метное стекло берут между большим и указательным пальцами левой руки. Отступя на 1 см от края стекла, лежащего ближе к указательному пальцу, наносят не­большую (диаметром 2 — 3 мм) каплю крови. Это де­лают обычно путем прикосновения поверхностью пред­метного стекла к капле крови на месте ее появления после прокола кожи. При изготовлении мазков из крови, взятой в пробирки, каплю ее наносят с помощью глаз­ной или пастеровской пипетки или краем пробки. Затем правой рукой устанавливают вблизи от капли крови шлифованное стекло под углом 30 — 45° и осторожно продвигают его до соприкосновения края стекла с каплей крови. После этого, плавно и не очень быстро, продвигая, справа, налево шлифованное стекло по пред­метному, приготовляют мазок.

Мазок должен начинаться на 1 — 1,5 см от края предмет­ного стекла и заканчиваться в 1 — 3 см от другого его края, составляя примерно 2/3 — 3/4 длины стекла. Мазок должен быть уже предметного стекла, с боков на стекле должны оста­ваться свободные поля шириной около 1 см. Хоро­ший мазок не имеет перерывов, пустот, на всем протяжении одинаковый по толщине. Хорошие мазки получаются при подогревании пред­метных стекол на резиновой грелке с теплой водой 45 — 50 °С, или на электрообогревательном столике к ми­кроскопу, или на стерилизаторе с горячей водой, закры­том крышкой; рекомендуется на этих же приспособле­ниях высушивать изготовленные мазки.

В холодное время необходимо предупреждать кон­денсацию паров воды на мазках крови, что может вы­звать ее гемолиз.

На высушенном мазке в начальной его части про­стым карандашом или иглой от шприца пишут номер животного (или порядковый номер записи исследуемых животных) и дату взятия крови.

Фиксация мазков. Мазки крови необходимо в течение 2 дней после изготовления или зафиксировать, или окра­сить. Нефиксированные мазки через месяц теряют спо­собность правильно окрашиваться.

Для фиксации мазки погружают в метиловый спирт (5 мин), этиловый спирт (30 мин), этиловый спирт и эти­ловый эфир поровну (30 мин) или денатурированный спирт (30 мин). Мазки помещают в кюветы с фиксато­ром и закрывают крышкой. Мазки не должны соприка­саться. После фиксации мазки высушивают на воздухе.

Окраска мазков. Качество окраски мазков зависит от многих факторов, в том числе и от рН воды, применяе­мой для разведения красок.

Для нейтрализации воды с кислой реакцией по ка­плям добавляют 1 %-ный раствор натрия гидрокарбона­та, пока розово-фиолетовая окраска не начнет появлять­ся в течение 1 — 5 мин. Для нейтрализации щелочной воды добавляют 1 %-ный раствор уксусной кислоты.

Метод Романовского— Гимза. Фиксиро­ванные препараты кладут мазком вниз на стеклянный мостик в кювете и наливают под них рабочий раствор краски (к 1 мл дистиллированной воды добавляют 2 ка­пли фабричного раствора краски Романовского — Гим­за). Окрашивание продолжается 15 — 30 мин. Продолжи­тельность окраски зависит от окружающей температуры (чем холоднее, тем продолжительнее окраска) и качества красителя. В заключение мазки промывают дистиллиро­ванной водой и сушат на воздухе.

Хорошо окрашенные мазки имеют розово-фиоле­товый цвет, не докрашенные — розовато-красноватый, а перекрашенные — темно-фиолетовый.

Выведение лейкограммы (лейкоцитарной формулы).

Лейкограммой называется про­центное соотношение между отдельными видами лейкоци­тов в крови.

Окрашенные мазки крови исследуют под микроскопом с иммерсией, для чего используют объектив х 90 и им­мерсионное масло, которое после исследования удаляют с препарата бензином, керосином, ксилолом или хлоро­формом.

В окрашенных мазках крови определяют величину, форму, характер окраски и структуру ядра, цитоплазмы и включений в нее, а также соотношение между раз­личными формами отдельных видов клеток крови.

Методы дифферен­циального подсчета лейкоцитов. Лейкограмму выводят по окрашенным мазкам крови путём дифференциального подсчёта под иммерсионной системой микро­скопа 100 (или лучше 200) лейкоцитов.

Четырехпольный метод. Дифференциальный подсчет лейкоцитов проводят таким образом, что с ка­ждой стороны мазка в начале и конце его (т. е. на 4 ис­следуемых участках) определяют по 25 лейкоцитов (всего 100 клеток). При этом от края мазка углубляются на 3 — 4 поля зрения, затем продвигаются на 2 — 3 поля вдоль мазка и возвращаются к его краю. Количество каждого вида лейкоцитов, обнаруженных при исследова­нии, регистрируют на 11-клавишном счетчике.

Трехпольный метод. При использовании трехпольного метода лейкоциты подсчитывают в 3 участках, расположенных поперек мазка (от одного края до другого). В начале мазка подсчитывают 35 кле­ток, в середине — 30 и в конце — 35 клеток.

Однопольный метод. Лейкоцитарную формулу определяют в средней части мазка, где, проходя поперек его от одного края до другого и обратно, подсчитывают 100 лейкоцитов.

При записи результатов выведения лейкограммы от­дельные виды лейкоцитов располагают в такой последо­вательности: базофилы (Б), эозинофилы (Э), нейтрофилы — миелоциты (М), юные (Ю), палочкоядерные (П), сегментоядерные (С), лимфоциты (Л), моноциты (М). Лейкограмма крови здоровых животных представлена в таблице.

Методика вычисления абсолютного ко­личества отдельных видов лейкоцитов в 1 мкл крови. Для этого необходимо подсчитать количе­ство лейкоцитов и вывести лейкограмму. Затем число лейкоцитов умножают последовательно на процент ка­ждого вида клеток лейкограммы и делят на 100, получая абсолютное число отдельных форм белых кровяных те­лец в 1 мкл крови (таб.3).

Таблица 3

studfiles.net

Приготовление мазков крови унифицированным методом

Мазки крови готовят на предметных стеклах, которые предварительно моют и обезжиривают.

Подготовка стекол

Реактивы.

Хозяйственное мыло — 2 % раствор или раствор стирального порошка: 20 г растворить в 975 мл воды и добавить 20 мл пергидроля.

Спирт этиловый 96%

Специальное оборудование не требуется.

Ход обработки стекол

Стекла (новые и бывшие в употреблении) помещают в эмалированную посуду в 2 % раствор хозяйственного мыла или стирального порошка на 8—10 ч. Кипятят в указанном растворе 5—10 мин, старые мазки предварительно стирают ветошью или ватным тампоном. Более длительное кипячение или использование алюминиевой посуды не рекомендуют, так как стекла мутнеют. Промывают в проточной воде. Насухо вытирают и помещают в этиловый спирт на 30—60 мин. Насухо вытирают чистым полотенцем и хранят в широкогорлой чистой посуде с притертой пробкой. Чистые стекла рекомендуется брать либо пинцетом, либо за края (соприкосновение пальцев с поверхностью стекла оставляет жирные следы).

Техника приготовления мазков

На сухое подготовленное описанным выше способом предметное стекло наносят мазок крови следующим образом. На стекло ближе к короткой стороне наносят стеклянной палочкой (или непосредственно из места укола пальца) небольшую каплю крови. Оставляют стекло в горизонтальном положении и размазывают каплю крови по стеклу с помощью чистого шлифованного стекла, помещая его под углом 45°; коротким ребром, подождав, пока вся кровь расплывется по нему, быстро проводят по предметному стеклу. Не следует сильно нажимать на стекло, так как при этом травмируются форменные элементы крови.

Мазки высушивают на воздухе и маркируют (лучше простым карандашом). Высохший мазок должен быть равномерно тонким, желтоватого цвета, достаточной величины (располагаться на 1—1,5 см от краев, занимать почти всю длину стекла) и оканчиваться «метелочкой». Толстые (густо-розового цвета) мазки не следует использовать, так как в них морфология клеток плохо различима.

labx.narod.ru


Смотрите также