Определение фагоцитарной активности лейкоцитов


Определение фагоцитарной активности лейкоцитов, анализ данных и функции клеток

14.08.2017

Благодаря существующим ныне медицинским технологиям и силе человеческой мысли диагностика заболеваний достигла впечатляющих успехов. К примеру, определить состояние иммунной системы человека возможно измерением количества лейкоцитов в крови. Как известно, лейкоциты, называемые еще «белой кровью» от латинского leiko- белая, kytos- клетка, защищают человеческий организм от вредоносных интервентов. Их главная функция — создать своеобразную оборонную линию от болезнетворных вирусов и бактерий, токсических веществ, инородных тел и шлаков.

Своя задача есть у каждого вида лейкоцитов. Одни из них активны в поиске посторонних элементов в организме. У других задача состоит в том, чтобы определить этот элемент на предмет «свой — чужой». Третий вид белых клеток настроен на передачу информации о работе лейкоцитов молодым клеткам, создавая так называемую «оборонную память». И последний аккорд в защите иммунной системы играют клетки, поглощающие вредоносные тела. Макрофаги полностью вбирают в себя интервента и растворяют его.

Метод исследования фагоцитарной активности лейкоцитов

Нейтрофилы в  крови, хоть и называются белыми тельцами, на самом деле под микроскопом имеют розово-фиолетовый цвет. Природную естественную защиту организма запрограммированные клетки осуществляют при помощи множественных гранул, содержащих биологически активные элементы.

Разновидности лейкоцитов

В медицинской терминологии существует пять наименований «белых клеток» лейкоцитов (приведено их процентное содержание в норме):

Лейкоциты способны к фагоцитозу. Фагоцитируют макрофаги в зависимости от состояния крови и нервной напряженности. Как правило, при начальной стадии заболевания количество нейтрофилов в крови человека растет, они борются и справляются с инородными болезнетворными агентами. К хроническому их повышению приводит неправильное лечение антибиотиками.

Анализ и подсчет

 Анализ требует предварительной подготовки: голодание несколько часов, абсолютная трезвость (употребление алкоголя и курение запрещено).

Определение фагоцитарной активности лейкоцитов проходит в несколько этапов:

Общее число поглощенных микробов делят на количество клеток, участвующих в фагоцитозе и получают фагоцитарное число (ФЧ). Эта цифра показывает, сколько микробов находится внутри одного фагоцита в среднем. Показатель тоже оценивается через полчаса (ФЧ30) и два часа (ФЧ120).

Индекс бактерицидности фагоцитов находят, разделив количество уничтоженных микробов на количество поглощенных и умножив получившуюся цифру на сто.

С целью оценки качества работы фагоцитов внесено понятие индекса завершенности фагоцитоза. Он представляет собой среднее количество поглощенных микробов через полчаса, отнесенное к среднему количеству поглощенных микробов через 2 часа, и отношение фагоцитарных индексов.

Анализ полученных данных при исследовании, нормы и отклонения

ИЗФ здорового человека должен быть равен единице. Данный анализ и его интерпретация, требующая определенных знаний, отражает всю картину иммунного состояния организма.

Лейкоцитоз

Фагоцитарная активность лейкоцитов при проведении исследований повышалась у мышей при изменении обычных условий жизни. Такое явление иногда возникает и у людей. Лейкоцитоз имеет физиологическую причину и может отмечаться у каждого человека. К примеру, повышенная активность белых кровяных телец проявляется при тривиальных бытовых факторах: стресс, перемена погоды, непривычная физическая нагрузка.

У женщин происходит скачок количества лейкоцитов во время беременности, при менструациях. Следует принять во внимание, что в подобных случаях увеличение лейкоцитов незначительно и происходит в одинаковых пропорциях для всех групп клеток. Для волнения нет повода. Однако существуют состояния, когда количество лейкоцитов возрастает в 2-3 раза выше нормы. Подобного рода рост клеток означает оборонительную реакцию и относится к патологическим.

Клетки разных групп растут непропорционально по причине заболевания или воспалительного процесса. Нейтрофильный лейкоцитоз — это когда клетки одной группы значительно преобладают по количеству. Наблюдается такой рост при инфекциях бактериального происхождения, остром  воспалении, отравлениях, обширной кровопотере, инфарктах и при стрессе или шоке.

Ослабление оборонных свойств иммунитета

У мышей, над которыми проводились опыты по исследованию макрофагов крови число нейтрофилов к старению значительно сокращается. Нарушение фагоцитарной активности нейтрофилов способствует снижению природного свойства организма бороться с заболеваниями и выводить шлаки и токсины. Примерно такая же практика снижения числа защитных клеток присутствует и в теле человека.

Естественным, физиологическим иммунодефицитом может сопровождаться старение. Также иммунитет снижает активность при радиоактивном облучении. Отчет Брауде говорит о том, что при однократном облучении мышей отмечается внезапное угнетение растворяющей способности макрофагов. Отсюда следует, что и  у организма человека, облученного гамма- или альфа лучами, ослабевает иммунитет.

Занимательный факт: Когда у мышей возникает чувство тревоги и опасности, в крови неконтролируемо растет число лейкоцитов и их подвижность. Подобным образом организм животного приготавливается к гипотетической необходимости  обороняться — купировать действие укусов, обеззараживать ранки. Этот алгоритм свойственен и человеку. В состоянии эмоционального напряжения содержание белых клеток в крови растет, формируя оборонительный барьер.

В реалиях сегодняшнего дня исследования крови на предмет иммунной защиты организма находят широкое применение.

lechiserdce.ru

Определение фагоцитарной активности лейкоцитов - презентация онлайн

. узнавания, захвата и поглощения разных чужеродных структур (разрушенных клеток, бактерий, комплексов антиген-антитело и др.). Клетки, осуществляющие фагоцитоз (нейтрофилы, моноциты, макрофаги), называются общим термином - фагоциты.микробов в 1 мл). Через 30 и 120 мин готовят мазки из этой смеси и окрашивают по Романовскому-Гимзе. Под микроскопом просматривают около 200 клеток и определяют количество фагоцитов, которые поглотили бактерии, интенсивность их захвата и уничтожения.клеток. 2. Фагоцитарный показатель - среднее число бактерий, находящихся в фагоците через 30 и 120 мин (производят математическое деление общего числа поглощенных фагоцитами бактерий на фагоцитарный индекс) 3. Индекс завершенности фагоцитоза - рассчитывается делением числа убитых бактерий в фагоцитах на общее число поглощенных бактерий и умножением на 100.120 мин - 92,0±2,5 2. Фагоцитарный показатель: через 30 мин 11,3±1,0, через 120 мин - 9,8±1,0 3. Индекс завершенности фагоцитоза: 66,3±2,6гломерулонефрит - с проявлениями иммунодефициталейкоцитов в крови (лейкоцитоз) 3. Аллергические реакции, аутоаллергические заболеваниясистеме неспецифического клеточного иммунитета. Это может быть связано со сниженной продукцией фагоцитов, быстрым их распадом, нарушением подвижности, нарушением самого процесса поглощения инородного анегта, нарушением процессов его уничтожения и др. Все это говорит о снижении устойчивости организма к инфекции. Чаще всего фагоцитарная активность снижается при: 1. На фоне тяжелых инфекций, интоксикаций, ионизирующего облучения (вторичный иммунодефицит) 2. Системных аутоиммунных заболеваний соединительной ткани (системная красная волчанка, ревматоидный артрит) 3. Первичных иммунодефицитов (синдром Чедиака-Хигаси, хроническая гранулематозная болезнь) 4. Хроническом активном гепатите, циррозе печени

ppt-online.org

4.4.6 Определение фагоцитарной активности клеток крови

4.4.6 Определение фагоцитарной активности клеток крови

Принцип метода. Метод основан на явлении фагоцитоза – реакции организма, проявляющейся в способности клеток-фагоцитов захватывать и переваривать чужеродные микроорганизмы.

Реактивы: 1. Стабилизатор крови.

2. Взвесь суточной микробной культуры (0,5-1 млрд.м.к./мл) в физрастворе.

Ход определения. В стерильные центрифужные пробирки наливают по 0,5 мл стабилизированной исследуемой крови и 0,5 мл микробной взвеси, содержащей по оптическому стандарту мутности 0,5-1 млрд. микробных клеток в 1 мл.

В зависимости от задач и целей исследований в работе могут быть ис-пользованы различные виды живых или убитых микроорганизмов: ки-шечная палочка, стафилококк, стрептококк и т.п.

Пробирку с приготовленной смесью осторожно встряхивают, поме-щают на 30 мин в термостат или водяную баню, отрегулированную на 37°С. По истечении указанного срока из смеси делают 3-5 мазков (по спо-собу приготовления мазков крови), фиксируют метиловым спиртом и окрашивают по Романовскому-Гимзе.

Расчет: Фагоцитарная активность лейкоцитов. Фагоцитарная ак-тивность выражается процентом активных лейкоцитов (фагоцитов) в об-щем числе подсчитанных нейтрофильных лейкоцитов. Из числа подсчи-танных 100 нейтрофилов выводится их процентное соотношение, т. е. лей-кограмма. По найденным 100 фагоцитам определяют число клеток, участ-вующих в фагоцитозе (захвативших определенное количество микробов). Полученный результат выражают в процентах.

Фагоцитарный индекс определяется средним числом фагоцитиро-ванных микробов, приходящихся на один активный лейкоцит. Этот пока-затель характеризует интенсивность фагоцитоза. Для определения фагоци-тарного индекса используют те же мазки крови, по которым определялась фагоцитарная активность лейкоцитов. В препаратах, приготовленных опи-санным выше способом, подсчитывают не менее 100 лейкоцитов и количе-ство поглощенных ими микробных тел. Вычисляется фагоцитарный индекс путем деления числа фагоцитированных бактерий на число активных лей-коцитов.

Фагоцитарное число является дополнительным показателем, харак-теризующим как агрессивность нейтрофилов, так и их активность. Вычис-ляется фагоцитарное число путем деления числа фагоцитированных бакте-рий на общее число подсчитанных лейкоцитов.

Фагоцитарная емкость определяется количеством микробных кле-ток, фагоцитированных лейкоцитами в 1 мм3 крови. Этот показатель ха-рактеризует общую фагоцитарную активность крови и зависит от количе-ства лейкоцитов, содержащихся в I мм3. Некоторые авторы этот показатель называют фагоцитарной интенсивностью, абсолютным фагоцитозом или общим фагоцитозом. Вычисляется фагоцитарная емкость умножением фа-гоцитарного числа на количество лейкоцитов в 1 мм3 крови.

При высокой функциональной активности фагоцитов процесс перева-ривания захваченных микробов начинается немедленно, и уже в первые 30 мин. отмечают не только визуальное изменение микробной клетки, но и преобразование некоторых нейтрофильных лейкоцитов (набухание, изме-нение очертания ядра, слабое прокрашивание и т.д.), т.е. появляются при-знаки, характеризующие автолиз (самораспад) и начало деструкции нейтрофила. В течение 2 ч фагоцитарная реакция в норме заканчивается перевариванием захваченных микробов и разрушением полиморфноядер-ных фагоцитов.

Для количественной оценки переваривающей способности фагоцитов введено понятие индекса завершенности фагоцитоза (ИЗФ), для этого определяют полусумму отношений фагоцитарной активности нейтрофи-лов, полученной через 30 мин. инкубации к фагоцитарной активности нейтрофилов, полученной через 2 ч, и отношения фагоцитарных индексов в эти же сроки. Принято считать, что при ИЗФ 1 и больше реакция счита-ется завершенной, а меньше 1 – незавершенной.

У новорожденных животных при значительных различиях в содержа-нии лейкоцитов целесообразно оценивать фагоцитарную активность клеток крови по элиминирующей их способности (ЭСК).

Под ЭСК понимается способность клеток, содержащихся в 1 мкл кро-ви, фагоцитировать антигенно-чужеродные частицы в течение 30 мин. и выражается количеством поглощенных за этот срок частиц (микробов и др.).

zoovet.info

2.3. Методы исследования функций фагоцитов.

С помощью лабораторных методов можно оценить следующие функции моноцитов и макрофагов: представление антигена Т-лимфоцитам, антителозависимую клеточную цитотоксичность, противоопухолевую цитотоксичность, хемотаксис, фагоцитоз и бактерицидную активность. Кроме того, можно исследовать продукцию цитокинов активированными макрофагами.

Исследуют такие функции нейтрофилов, как хемотаксис, адгезию, фагоцитоз, бактерицидную активность и продукцию свободных радикалов кислорода.

2.3.1. Методы определения хемотаксиса лейкоцитов. Направленное движение лейкоцитов в сторону стимулирующего агента – хемоаттраканта называется хемотаксисом. Хемотаксис нейтрофилов исследуют с помощью камеры Бойдена. Эта камера состоит из двух отделений, между которыми находится фильтр. В одно отделение камеры помещают суспензию нейтрофилов, в другое – хемотаксический фактор, например С5a. После инкубации нейтрофилов в камере Бойдена определяют, какое их количество мигрировало на противоположную сторону фильтра. Для исследования хемотаксиса нейтрофилов in vivo используется метод кожного окна. С помощью скальпеля удаляют поверхностный слой эпидермиса площадью 4 мм2 (при этом должно появиться небольшое количество крови). На поврежденный участок помещают покровное стекло. В течение суток каждые 0,5—2 ч покровное стекло меняют. Затем стекла окрашивают и исследуют под микроскопом находящиеся на них лейкоциты. В норме в течение первых 2 ч наблюдается приток нейтрофилов к месту повреждения. В течение последующих 12 ч нейтрофилы замещаются моноцитами.

Нарушения хемотаксиса наблюдают при ряде врожденных заболеваний фагоцитарной системы: синдромах Чедиака-Хигаси, дефектах адгезии лейкоцитов, при вторичных иммунодефицитных состояниях.

2.3.2. Определение адгезивных свойств. За адгезивные свойства нейтрофилов и моноцитов отвечают поверхностные рецепторы – селектины и интегрины. Обычно определяют экспрессию поверхностных антигенов CD11a, CD18, CD11b, CD11c с помощью моноклональных антител в методе проточной цитометрии. При иммунодефицитах, обусловленных нарушением адгезии лейкоцитов, наблюдается снижение экспрессии этих антигенов, как на покоящихся, так и на активированных клетках. Для определения функциональной активности адгезивных молекул фагоцитов используется оценка их способности прикрепляться к пластику, стеклу, культуре эпителиальных клеток.

Нарушение адгезивных свойств фагоцитирующих клеток наблюдают при врожденных синдромах, связанных с нарушением экспрессии молекул адгезии – ЛАД-синдром I-го и II-го типа. К лабораторным признакам этих иммунодефицитов относится также нейтрофильный лейкоцитоз. Иммунодефициты, обусловленные нарушением адгезии лейкоцитов, проявляются рецидивирующими инфекциями, медленным заживлением ран и отсутствием гнойного отделяемого в очагах инфекции.

2.3.3. Определение фагоцитарной способности. Традиционным методом оценки стадии поглощения является подсчет в окрашенных препаратах числа частиц, захваченных нейтрофилами и моноцитами (фагоцитарный индекс), и количество частиц, захваченных одной клеткой (фагоцитарное число). В качестве объекта фагоцитоза используют различные бактерии, простейшие или синтетические частицы (латекс, зимозан). Оценка фагоцитоза с помощью проточной цитометрии является наиболее точным, быстрым и объективным методом.

Определение фагоцитоза имеет значение в комплексной диагностике при первичных (синдром Чедиака-Хигаси) и вторичных иммунодефицитах.

2.3.4. Оценка бактерицидной активности. Определение внутриклеточной гибели микробов показывает завершенность фагоцитарного процесса и является суммарным показателем функциональной активности фагоцитарных клеток. Бактерицидность фагоцитов обусловлена кислородозависимыми (образование активных форм кислорода в процессе кислородного взрыва) и кислородонезависимыми (ферменты гранул) механизмами. Для оценки киллинга используют простейший микроскопический метод идентификации дегенеративных, полуразрушенных микробов в окрашенных препаратах лейкоцитов. Надежным и простым методом оценки внутриклеточной гибели микробов является проточная цитометрия с использованием флюоресцентных красителей, дифференцированно окрашивающих живые и убитые микробные клетки.

С целью определения образования активных форм кислорода используют НСТ-тест и проточную цитометрию. НСТ-тест основан на восстановлении нитросинего тетразолия (НСТ) супероксидным анионом, образующимся при кислородном взрыве в лейкоцитах. Суть метода заключается в следующем: к фагоцитам добавляют желтый краситель нитросиний тетразолий, при его поглощении метаболическая активность фагоцитов возрастает, нитросиний тетразолий восстанавливается, продукты этой реакции окрашены в синий цвет. Реакцию учитывают микроскопически по количеству темно-синих гранул диформазана в клетке, образующихся при восстановлении НСТ.

Отсутствие восстановления нитросинего тетразолия — характерный признак хронической гранулематозной болезни. НСТ-тест позволяет идентифицировать синдром Чедиака-Хигаси, дефицит миелопероксидазы, глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназы и другие первичные иммунодефициты фагоцитарного звена. Повышенная способность фагоцитов к образованию активных форм кислорода наблюдается при воспалительных процессах инфекционной природы в организме.

2.4. Методы оценки системы комплемента.

Комплемент — это группа сывороточных белков, состоящая из протеаз и их активаторов. Существуют два механизма активации комплемента — классический и альтернативный. Комплемент играет важную роль в защите от микробов, активирует катаболизм циркулирующих иммунных комплексов и участвует в регуляции функций иммунной системы.

Для исследования компонентов классического пути активации комплемента определяют его гемолитическую активность. Суть метода заключается в следующем: 1) разные разведения сыворотки больного и нормальной сыворотки добавляют к эритроцитам барана, покрытым антителами; 2) степень гемолиза оценивают фотометрически по выходу гемоглобина в раствор. За единицу гемолитической активности комплемента принимают величину, обратную тому разведению сыворотки, при котором разрушаются 50% эритроцитов. Определение гемолитической активности комплемента позволяет обнаружить недостаточность компонентов комплемента, прежде всего участвующих в образовании мембраноатакующего комплекса. Кроме того, оценка этого показателя может использоваться для выявления активации комплемента, например при системной красной волчанке и гломерулонефрите, хотя чувствительность метода для этого недостаточно высока. Альтернативный путь активации комплемента исследуют редко.

Определение компонентов комплемента обычно проводят при обследовании больных с аутоиммунными заболеваниями и при подозрении на генетический дефект комплемента. Количественное определение компонентов комплемента проводят с помощью простой радиальной иммунодиффузии и нефелометрии. Так, у 15% больных с наследственным ангионевротическим отеком количественные методы исследования выявляют нормальный уровень ингибитора C1-эстеразы, в то время как его активность снижена. Функциональную активность отдельных компонентов комплемента в сыворотке исследуют следующим образом: 1) к стандартной сыворотке, лишенной какого-либо компонента комплемента, добавляют исследуемую сыворотку (источник недостающего компонента комплемента); 2) определяют гемолитическую активность комплемента. Если гемолитическая активность комплемента не восстанавливается до нормы, значит, активность этого компонента комплемента в исследуемой сыворотке снижена. Иногда дополнительно оценивают активность регуляторных компонентов комплемента, например ингибитора C1-эстеразы.

studfiles.net


Смотрите также