Подсчет количества эритроцитов


Работа № 3. Определение количества эритроцитов в крови

3.1. Подсчет количества эритроцитов в камере Горяева

Принцип метода состоит в подсчете эритроцитов в камере Горяева. Для уменьшения концентрации форменных элементов и создания удобной для подсчета их концентрации кровь предварительно разводится стандартным образом.

Ход работы

Пипеткой отмерьте 4 мл разводящего раствора (3,5% раствор NaCl) и вылейте в сухую пробирку. Капилляр Сали обработайте раствором цитрата натрия.

Из прокола пальца (работа № 1) выпустите свежую каплю крови, приставьте к ней кончик капилляра Сали и наполните его до отметки 0,02. Это соответствует объему 0, 02 мл или 20 мкл. Вытрите кончик капилляра и выпустите кровь в пробирку с разводящим раствором. Полученное таким образом разведение крови - 1:200.

После тщательного перемешивания раствора крови небольшой каплей заполните подготовленную - с притертым стеклом камеру Горяева. Камеру перед заполнением промойте водой и насухо вытрите. На участок камеры, где нанесены сетки, уложите обезжиренное покровное стекло, при этом нижняя поверхность камеры должна находиться на третьих пальцах обеих рук, двумя вторыми пальцами придерживайте ее спереди. Двумя пальцами притрите покровное стекло, плавно продвигая его по поверхности прямоугольных пластинок до появления цветных колец Ньютона в местах соприкосновения покровного стекла с поверхностью пластинок камеры.

Каплю исследуемой жидкости пипеткой поместите перед щелью, образованной покровным стеклом и пластинкой камеры Горяева с нанесенной сеткой. Капля должна заполнить камеру самотеком (под действием капиллярных сил). Следите, чтобы в пространстве над сеткой не было пузырьков воздуха и избытка жидкости.

До начала подсчета оставьте счетную камеру на 1 - 2 мин для осаждения форменных элементов. Камеру положите на столик микроскопа и настройте его на малое увеличение (объектив 8 - 9, окуляр 10 или 15). Подсчет производите при несколько опущенном конденсоре. Хорошую контрастность обеспечивает фазово-контрастное устройство. Эритроциты считайте в пяти больших квадратах, состоящих из 16 малых (5  16 = 80 малых), расположенных по диагонали. Для записи результатов рекомендуется предварительно расчертить на листе 5 больших квадратов, разлинованных 4х4 и записывать найденное число эритроцитов в каждую клеточку. При подсчете необходимо помнить правило буквы «Г».

Подсчитав число эритроцитов в 80 маленьких квадратах (N) рассчитывают число клеток в 1 мкл (мм3) крови (X). Для этого учитывается разведение в 200 раз, объем камеры над одним маленьким квадратиком 1/4000 мкл и то, что клетки подсчитывались в 80 таких квадратах. Таким образом, формула для вычисления количества эритроцитов следующая:

Х=(Nх4000х200)/80

Полученное количество эритроцитов можно также выразить в количестве на 1л крови (умножением полученного количества на 106), что является стандартной размерностью этого показателя.

Рекомендации по оформлению протокола работы. Выводы делаются исходя из того, что в норме количество эритроцитов должно составлять: 3,6-4,5 х 1012 кл/л для женщин; 4,5 - 5 х 1012 кл/л - для мужчин. После небольшой нагрузки – 5 - 5,5 х 1012 кл/л.

Сразу после рождения количество эритроцитов составляет около 6,0 х 1012 кл/л (колебания в пределах 5,4 - 7,2 х 1012 кл/л). С конца первых — начала вторых суток жизни обычно происходит снижение числа эритроцитов в крови, наиболее выраженное на 5 - 7-й день. Минимального значения этот показатель достигает к 2 - 3 мес, а затем несколько увеличивается и в дальнейшем (с 5 - 6-го месяца) поддерживается на уровне взрослых.

Если количество эритроцитов выше нормы, то это явление называется эритроцитоз, а если меньше, то эритропения или анемия. Увеличение количества эритроцитов в крови (эритроцитоз) встречается при гемоконцентрации (ложный эритроцитоз), а также при усилении эритропоэза на фоне неизменной интенсивности гемолиза (истинный эритроцитоз). Уменьшение количества эритроцитов в крови может наблюдаться при гемодилюции (ложная эритропения).

studfiles.net

Эритроциты

Подсчет количества

В качестве унифицированных методов подсчета эритроцитов в крови приняты два метода; подсчет в счетной камере и в автоматическом счетчике.

Унифицированный метод подсчета в счетной камере (1972).

Принцип.

Подсчет эритроцитов под микроскопом в определенном количестве квадратов счетной сетки и пересчет на 1 мкл крови, исходя из объема квадратов и разведения крови.

Реактивы. 0,9 % раствор хлорида натрия.

Специальное оборудование.

1.Счетная камера Горяева.

2. Микроскоп.

Ход исследования.

Разводят исследуемую кровь в 200 раз.

Для этого в сухую пробирку отмеривают 4 мл реактива 1.

Пипеткой набирают 0,02 мл крови.

Кончик пипетки вытирают фильтровальной бумагой или марлей и кровь выдувают на дно пробирки; пипетку тщательно промывают в верхнем слое жидкости, повторно набирая ее и выдувая в пробирку, содержимое пробирки перемешивают и оставляют стоять до момента счета (рекомендуется считать эритроциты в ближайшие 2-3 ч после взятия крови, а при гемолитических и В12-дефицитных анемиях — сразу после взятия, так как эритроциты могут разрушиться). Недопустимо оставлять взятую кровь с несосчитанными эритроцитами на следующий день, так как эритроциты частично разрушаются.

Подготавливают счетную камеру: протирают насухо камеру с сеткой и покровное стекло, затем покровное стекло притирают к камере, слегка надавливая на стекло таким образом, чтобы по краям его появились радужные полосы (это свидетельствует о требуемой высоте камеры — 0,1 мм).

Заполняют счетную камеру разведенной кровью: предварительно несколько раз тщательно встряхивают содержимое пробирки, затем пастеровской пипеткой или стеклянной палочкой отбирают каплю разведенной крови и подносят ее к краю покровного стекла, следя за тем, чтобы она равномерно без пузырьков воздуха заполнила всю поверхность камеры с сеткой, не затекая в бороздки. Заполненную камеру оставляют

в горизонтальном положении 1 мин (для оседания эритроцитов).

Для подсчета эритроцитов, не меняя горизонтального положения камеры, помещают ее на столик микроскопа и с помощью малого увеличения микроскопа (объектив 10Х, окуляр 10Х) находят верхний левый край сетки (для лучшего контрастирования следует опустить конденсор и прикрыть диафрагму). Счет производят в 5 больших квадратах, разделенных на 16 малых, т. е. в 80 малых квадратах. Рекомендуется считать клетки в квадратах сетки, расположенных по диагонали. Для того чтобы одни и те же эритроциты, лежащие на линиях, не попали дважды в счет, принято для каждого квадрата, кроме элементов, лежащих внутри квадрата, считать расположенные на определенных двух линиях (например, на левой и верхней).

Расчет количества эритроцитов в 1 мкл крови производят, исходя из разведения крови (200), числа сосчитанных квадратов (80) и объема 1 малого  квадрата по следующей формуле:

X= а*4000*200/80

где X число эритроцитов в 1 мкл крови;

a — число сосчитанных эритроцитов.

В результате сокращения X = а*10 000.

Подсчет эритроцитов в счетной камере является трудоемким и недостаточно точным методом. На результатах подсчета сказываются малейшая неточность при взятии крови в пипетку, неудовлетворительная градуировка пипеток, неравномерное заполнение камеры, любое отклонение от правил подготовки счетной камеры, ее заполнения и подсчета клеток.

Нормальные величины. Количество эритроцитов в крови, по данным В. В. Соколова, а также И. А. Грибовой (1979), составляет 4-10*6 — 5,1-10*6 в 1 мкл

labx.narod.ru

Анализ количества эритроцитов

Принцип. Подсчет количества эритроцитов под микроскопом в определенном количестве квадратов счетной камеры и пересчет на 1 мкл или 1 л крови в соответствии с объемом и разведением крови.

Реактивы:

Ход определения. Исследуемую кровь необходимо развести в 200 раз. Для этого в пробирку наливают 4 мл разводящей жидкости. В пипетку набирают 0,02 мл крови. Кончик пипетки вытирают фильтровальной бумагой или марлей, кровь выдувают на дно пробирки, а пипетку промывают верхним слоем жидкости, повторно набирая и выдувая ее в пробирку (пипетируя). Содержимое пробирки перемешивают и оставляют до исследования. Эритроциты рекомендуется считать с помощью счетной камеры не позднее 3 ч после взятия крови.

Устройство и подготовка к работе счетной камеры Горяева. Счетная камера Горяева (далее — камера) представляет собой толстое, прозрачное, прямоугольное стекло с двумя сетками, выгравированными на его поверхности. На боковых участках стекла нанесены основные показатели и название камеры. Сетки отделены друг от друга поперечной канавкой, что препятствует затеканию жидкости из одной сетки в другую при ее заполнении. Двумя глубокими продольными канавками сетки отделены от стеклянных прямоугольных пластинок, к которым притираются шлифованные покровные стекла. Поверхность этих пластинок находится на 0,1 мм выше участков камеры, на которые нанесена сетка. Сетка камеры Горяева образована системой разграничительных линий, проведенных взаимно перпендикулярно. Она состоит из 3600 малых квадратов, сторона которых равна 0,05 (1/20) мм; высота камеры, создающаяся при притирании шлифованного покровного стекла, составляет 0,1 мм; площадь — 1/400 мм2; объем — 1/4000 мм3 (мкл); и 225 больших квадратов со стороной 1/5 мм; площадью 1/25 мм2 и объемом 1/250 мм3 (мкл). Длина стороны всей сетки составляет 3 мм, площадь — 9 мм2, объем — 0,9 мм3 (мкл).

Камеру перед работой тщательно моют водой, вытирают насухо; так же подготавливают шлифованное покровное стекло. Камеру Горяева берут в руку. На участок камеры, где нанесена сетка, укладывают шлифованное покровное стекло. Затем стекло берут и другой рукой, при этом нижняя поверхность камеры находится на двух средних пальцах, два вторых пальца придерживают ее спереди. Свободными двумя первыми пальцами притирают шлифованное покровное стекло, плавно продвигая его по поверхности прямоугольных стеклянных пластинок до появления цветных колец Ньютона в местах плотного прилегания (притирания) покровного стекла к поверхности прямоугольных пластинок камеры (это свидетельствует о высоте камеры — 0,1 мм).

Заполнение камеры Горяева. Заполняют счетную камеру разведенной кровью, предварительно несколько раз встряхнув содержимое пробирки. Затем пастеровской пипеткой или стеклянной палочкой с оплавленным концом отбирают каплю разведенной крови и подносят ее к щели, образующейся между шлифованным стеклом (покровным) и счетной камерой, жидкость заполняет пространство над сеткой. Обычно одну из сеток заполняют для подсчета эритроцитов, другую — для подсчета лейкоцитов. При заполнении камеры следят за тем, чтобы в пространстве над сеткой не было пузырьков воздуха и жидкость не затекала в бороздки.

Заполненную камеру оставляют в горизонтальном положении на 1 мин для оседания эритроцитов.

Подсчет клеток. Не меняя горизонтального положения, камеру помещают на столик микроскопа и с помощью малого увеличения (объектив 8х, окуляр 10х) находят верхний (дальний) левый край сетки (для лучшего контрастирования опускают конденсор и прикрывают диафрагму). Считают эритроциты в 5 больших квадратах, разделенных на 16 малых, т. е. в 80 малых квадратах. Рекомендуется считать клетки в квадратах, расположенных по диагонали сетки. Для того чтобы одни и те же эритроциты, лежащие на линиях, не попали в счет дважды, принято для каждого квадрата, кроме клеток, лежащих внутри квадрата, считать расположенные на двух определенных линиях (например, левой и верхней).

Расчет количества эритроцитов в 1 мкл крови производят по формуле:

где X — число эритроцитов в 1 мкл крови; а — число сосчитанных эритроцитов; 200 — степень разведения крови; 80 — число просчитанных малых квадратов; 1/4000 — объем малого квадрата в мкл.

Причины ошибок.

  1. Неточность при взятии крови в пипетку.
  2. Неудовлетворительная градуировка пипеток.
  3. Образование сгустка крови.
  4. Неправильное притирание покровного стекла камеры или недостаточная его толщина (менее 0,3 мм).
  5. Подсчет сразу после заполнения камеры, когда клетки еще не успели осесть на дно.
  6. Плохо вымытые и недостаточно высушенные пипетки и пробирки.
  7. Недоброкачественность реактивов, вызывающая гемолиз.
  8. Любое отклонение от правил подготовки камеры, ее заполнения и подсчета клеток.

Примечание. При гемолитических анемиях, В12-дефицитной анемии подсчет эритроцитов следует осуществлять незамедлительно после взятия крови, так как они быстро разрушаются.

Методика автоматического подсчета эритроцитов

Осуществляется с помощью счетчиков и гематологических анализаторов, выпускаемых различными фирмами, например, Becman Coulter (Швейцария), Sysmex (Япония), Hoffman-La Roche (Швейцария), Serono (США) и др.

При работе с гематологическими счетчиками подготовка пробы (разведение) осуществляется вручную. При использовании гематологических анализаторов отбор пробы крови и ее обработка происходят без участия лаборанта.

Принцип работы большинства анализаторов основан на кондуктометрическом методе: определенное количество разведенной изотоническим раствором натрия хлорида или другого электролита крови пропускается через микроотверстие, проходящая через него клетка увеличивает сопротивление между электродами, и возникающий импульс передается на счетное устройство с цифровой индикацией.

Ход исследования выполняется в соответствии с инструкцией, прилагаемой к анализатору.

Нормальные величины. Количество эритроцитов в крови здорового человека, по данным А. И. Воробьева (1985), у мужчин составляет 4,0— 5,1 × 1012/л, у женщин — 3,7—4,7 × 1012/л.

Клиническое значение. Снижение количества эритроцитов (эритроцитопения) — один из основных критериев анемического синдрома. От истинной анемии необходимо отличать гидремию, связанную с увеличением объема плазмы за счет притока тканевой жидкости (например, при схождении отеков). Причинами анемий служат кровопотери, нарушения кроветворения в костном мозге (дефицит железа, фолиевой кислоты, витамина В12, апластические процессы) и повышенный гемолиз. Степень эритроцитопении варьируется и в тяжелых случаях (апластическая анемия, гемолитическая анемия в период криза, В12-дефицитная анемия) может достигать 1 × 1012/л и менее. Кроме этого, уменьшение количества эритроцитов наблюдается при лейкозах, множественной миеломе, неходжскинских лимфомах, системной красной волчанке, ревматоидном артрите, метастазах злокачественных опухолей и др., а также при недостаточном содержании белка в пище, голодании, вегетарианской диете.

Увеличение количества эритроцитов в единице объема крови называется полиглобулией или эритроцитозом. В физиологических условиях полиглобулия наблюдается у новорожденных первые 3 дня жизни (временное сгущение крови в результате потери жидкости организмом при внезапном переходе к легочному дыханию и кожной респирации), у взрослых — при усиленном потоотделении, голодании. При подъемах на большую высоту эритроцитоз обусловлен не сгущением крови, а действительным повышением продукции эритроцитов в связи с гипоксией. Эритроцитозы наблюдаются при патологических состояниях как симптомы целого ряда заболеваний (вторичные эритроцитозы). Вторичные симптоматические эритроцитозы делят на абсолютные и относительные. Причиной абсолютных полиглобулий является реактивное усиление эритропоэза с увеличением массы циркулирующих эритроцитов (при врожденных пороках сердца, хроническом обструктивном бронхите, гипернефроидном раке, гемангиобластоме мозжечка и др.). Сгущение крови без увеличения количества эритроцитов в результате уменьшения объема плазмы при длительной рвоте, диарее, ожогах лежит в основе относительных полиглобулий.

От симптоматических эритроцитозов следует отличать заболевания крови, относящиеся к гемобластозам и протекающие с увеличением количества эритроцитов, а порой лейкоцитов и тромбоцитов (истинная полицитемия).

onlab.info

Эритроциты (erytrocytus)

Наряду с определением гемоглобина, подсчет красных кровяных телец (эритроцитов) является важнейшим исследованием при оценке анемических состояний.

В норне содержание эритроцитив у

мужчин — 4,0–5,0 × 1012/л женщин — 3,7–4,7 × 1012/л

Эритроцит представляет собой обычно двояковогнутую клетку — дискоцит — диаметром 6–8 мкм, круглой или овальной формы, при окраске по Романовскому розового цвета (рис. 2).

Объем эритроцита — 90 мкм3, площадь — 140 мкм2, наибольшая толщина — 2,4 мкм, мини- мальная — 1 мкм. Эритроцит имеет плазмолемму и строму. Плазмолемма избирательно проницаема для ряда веществ, главным образом для газов, кроме того, в ней находятся различные антигены.

В строме также содержатся антигены крови, вследствие чего она в определенной степени обуславливает групповую принадлежность крови. Кроме того, в строме эритроцитов находится дыхательный пигмент гемоглобин, который обеспечивает фиксацию кислорода и доставку его к тканям.

Сухое вещество эритроцита содержит около 95 % гемоглобина и только 5 % приходится на долю других веществ, в т. ч. негемоглобиновых белков и липидов.

Эритроциты активно участвуют в регуляции кислотно-основного со стояния организма, адсорбции токсинов и антител, процессе свертыва- ния крови, а также в ряде ферментативных процессов.

Существуют следующие методы подсчета количества эритроци тов:

  1. Метод камерного подсчета эритроцитов. Предложено много камер для подсчета кровяных клеток (камера Бюркера, Горяева, Тома, Предтеченского, Нейбауэра и др.). Наиболее часто при условиях работы, существующих в Украине, применяется сетка Горяева;
  2. Фотометрические методы (с помощью приборов: эритрогемометров и электрофотоколориметров). Принцип работы этих приборов состоит в определении числа эритроцитов путем измерения с помощью фотоэлемента количества света при прохождении его через взвесь эритроцитов;
  3. Электронно-автоматические методы подсчета. Принцип работы заключается в изменении клетками крови сопротивления электрической цепи при прохождении их через узкий капилляр, что регистрируется с помощью электромагнитного счетчика. Каждая клетка отражается на осциллоскопическом экране и регистрируется автоматическим счетчиком.

В клинике пользуются преимущественно способами камерного и фотометрического подсчета эритроцитов.

Счетная камера Горяева состоит из 225 больших квадратов (рис. 3а). Часть этих квадратов разделена на 16 маленьких квадратов. Сторона маленького квадрата равна 1/20 мм, площадь — 1/400 мм2, высота камеры — 1/10 мм, поэтому объем пространства над этим квадратом — 1/4000 мм3.

В настоящее время широкое распространение получил более простой пробирочный метод взятия крови для подсчета форменных элементов:

  1. в сухие чистые пробирки заранее наливают разводящую жидкость для эритроцитов — 4 мл 2% раствора хлористого натрия;
  2. кровь набирают в капиллярную пипетку от гемометра Сали немного выше метки 20 мкл, а затем, обтирая кончик капилляра сухой ватой, доводят столбик до метки;
  3. кровь выдувают на дно пробирки; пипетку тщательно промывают в верхнем слое жидкости. Содержимое пробирки перемешивают. При внесении 20 мкл крови в 4 мл раствора NaCl получается разведение в 200 раз, что необходимо для подсчета эритроцитов;
  4. подсчет эритроцитов производится далее в счетной камере Горяева. Чистое и сухое покровное стекло притирают к камере так, чтобы в местах их соприкосновения образовались радужные кольца;
  5. перед заполнением камеры содержимое пробирки несколько раз перемешивают, затем концом круглой стеклянной палочки отбирают из пробирки, наклоняя ее, каплю крови и подносят к краю шлифованного стекла камеры. Если одной капли недостаточно для полного заполнения камеры, то дополняют ее другой каплей;
  6. после заполнения камеру оставляют на 1–2 мин в покое для оседания форменных элементов крови, а затем помещают ее под микроскоп;
  7. подсчитывают форменные элементы при малом увеличении микроскопа (объектив ×8 или ×9, окуляр ×10 или ×15) при затемненном поле зрения (с прикрытой диафрагмой и при опущенном конденсоре);
  8. считают эритроциты в 80 малых квадратах, что соответствует 5 большим квадратам, расположенным по диагонали (рис. 3б);
  9. по правилам, счету подлежат эритроциты, лежащие внутри маленького квадрата, и те, которые находятся на левой и верхней его границах (рис. 4).

Подсчитав количество эритроцитов в 80 малых квадратах, рассчитывают по формуле количество эритроцитов в 1 мм3 крови и в 1 литре крови:

где А — количество эритроцитов в 80 малых квадратах; П — степень разведения (200).

Метод не трудоемок и удобен для серийной работы, однако недостатком его является зависимость результата не только от количества эритроцитов, но и от их размера, а также от концентрации гемоглобина.

Норма:

Уменьшение количества эритроцитов (олигоцитемия = эритропения) характерно для:

Увеличение числа эритроцитов (полицитемия = эритремия) может быть первичным:

или вторичным:

Морфологическое исследование красных кровяных телец является ценным дополнением к определению их общего числа и к исследованию гемоглобина.

Оно дает возможность открыть ряд важных в диагностическом и про гностическом отношении патологических изменений в эритроцитах. Часто не представляется возможным поставить диагноз какого-нибудь заболевания крови, а особенно провести дифференциальную диагностику анемий, не зная морфологии красных кровяных телец. Поэтому картина крови не может считаться полноценной, если в ней нет подробного описания морфологии эритроцитов.

Для клинических целей морфологию эритроцитов лучше всего исследовать на препарате, окрашенном по Романовскому — Гимза. Техника приготовления препаратов крови и их окраски по Романовскому — Гимза описаны в разделе о морфологии лейкоцитов. В этом случае удачно сделанный мазок и хорошая окраска препарата являются необходимым условием для правильного учета морфологических особенностей.

Анизоцитоз — состояние, при котором одновременно обнаруживаются эритроциты различной величины. Диаметр эритроцитов крови здорового человека равен 6–8 мкм. При анемиях различного характера величина эритроцитов меняется.

Микроциты — эритроциты с диаметром меньше 6 мкм — характерны для железодефицитных анемий, макроциты — эритроциты диаметром больше 9 мкм — наблюдаются при заболеваниях печени (особенно вызванных алкоголем) и после спленэктомии.

Мегалоциты — крупные (около 12 мкм), овальные гиперхромные эритроциты, образующиеся при созревании мегалобластов — появляются в крови при недостатке в организме витамина В12 и фолиевой кислоты (рис. 5).

При патологических условиях созревания эритроцитов наряду с анизоцитозом отмечается изменение их формы — пойкилоцитоз: появляются эритроциты вытянутой, овальной, грушевидной, серповидной, шаровидной формы и т. д. (рис. 6).

При недостаточной эритропоэтической функции костного мозга из него поступают в кровь незрелые «ядерные» элементы красной крови — нормобласты и эритробласты. В условиях патологического созревания в эритроцитах могут сохраняться остатки ядра в виде «телец Жолли» — круглых хроматиновых образований диаметром 1–2 мкм, окрашивающихся в вишнево-красный цвет; и «колец Кебота» — остатков оболочки ядра красного цвета, имеющих вид колец, восьмерки и т. д. (рис. 7). Встречаются в основном при В12-дефицитной анемии.

Базофильная зернистость эритроцитов представлена в виде синих зернышек (рис. 7). Такие эритроциты встречаются при интоксикациях свинцом или тяжелыми металлами, талассемии, В12- и фолиево-дефицитной анемии, алкогольной интоксикации и в результате цитотоксического действия лекарственных препаратов.

Жив ли Христос? Воскрес ли Христос из мертвых? Исследователи изучают факты

dyagnoz.ru


Смотрите также