Определение количества эритроцитов


Определение количества эритроцитов

СПОСОБЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОЛИЧЕСТВА ЭРИТРОЦИТОВ В 1 МКЛ КРОВИ

Метод подсчета в счетной камере

Принцип метода. В строго определенном объеме камеры подсчиты­вают под микроскопом клеточные элементы, а затем производя! пересчет полученного результата на 1 мкл крови. Кровь предвари­тельно разводят с целью уменьшения числа клеток, подлежащих сче­ту. Самым удобным и достаточно точным является способ разведе­ния крови в пробирках. Применяемый широко ранее забор крови в смесители-меланжеры в настоящее время употребляется мало. Про­бирочный метод, предложенный Н. М. Николаевым, заключается в следующем. В предварительно высушенную чистую коническую про­бирку точно отмеривают пипеткой 4 мл разводящей жидкости и осто­рожно выдувают в нее 0,02 мл капиллярной крови (кровь забирают пипеткой от гемометра Сали). Полученное разведение 1:202 можно практически принять равным 1:200. Взвесь тщательно перемешивают и затем заполняют камеру.

В Советском Союзе обычно пользуются камерой с двумя сетками Горяева разграниченными глубокой поперечной ка­навкой. Сбоку от сеток находятся стеклянные прямоугольные плас­тинки, к которым притираются специальные шлифованные покров­ные стекла.

Сетка Горяева состоит из 225 больших квадратов (15 15). Боль­шие квадраты, расчерченные вертикально и горизонтально на 16 ма лых квадратов, чередуются с квадратами, разделенными только вер­тикальными или горизонтальными линиями, и с квадратами чисты­ми, без линий. Глубина камеры равна '/ю мм, сторона малого квад­рата — 'До мм; таким образом, объем малого квадрата равен 4000 ММ3.

Это важно помнить для правильного расчета числа эритроцитов или других клеточных элементов в 1 мкл крови.

Перед заполнением камеру и шлифованное покровное стекло мо­ют и высушивают. Покровное стекло притирают к камере так, чтобы появились радужные, ньютоновые кольца (только при этих условиях соблюдается правильный объем камеры). Каплю разведенной крови вносят пипеткой под притертое покровное стекло камеры. После за­полнения камеру оставляют на 1 —2 мин в покое для оседания формен­ных элементов, затем приступают к подсчету при малом увеличении микроскопа в затемненном поле зрения (прикрытой диафрагме и не­сколько опущенном конденсоре).

Эритроциты считают в 5 больших квадратах (5'16 = 80 малым квадратам), расположенных по диагонали, поскольку распределение клеток в камере может быть неравномерным. Для этого под микрос­копом отыскивают левый верхний большой квадрат (разграфленный), подсчитывают количество находящихся в нем эритроцитов, затем по диагонали вниз и направо находят следующий разграфленный квад­рат и т. д. Чтобы не сосчитать дважды одни и те же клетки, пользуются следующим правилом (рис. 5): счету подлежат все клетки внутри ма­лого квадрата и лежащие на пограничных линиях, если они большей своей половиной заходят внутрь данного квадрата. К ним, кроме того, присчитывают эритроциты, пересекаемые пограничными линиями по­полам, но только те из них, которые находятся на верхней и левой линиях, так как клетки, лежащие на двух других линиях, будут сосчи­таны в следующих квадратах. Эритроциты, расположенные большей своей частью вне данного квадрата, не считают.

studfiles.net

Определение количества эритроцитов

Главная / Справочник по клинической лабораторной диагностике / Исследование крови / Эритроциты / Определение количества эритроцитов

Метод подсчета в счетной камере

Кровь предварительно разводят с целью уменьшения числа клеток, подлежащих счету. В химические пробирки отмеривают пипеткой по 4 мл 3%-ного раствора хлорида натрия и осторожно выдувают в нее 0,02 мл капиллярной крови (кровь забирают пипеткой от гемометра Сали). Полученное разведение можно практически принять равным 1 : 200. Взвесь тщательно перемешивают и затем заполняют камеру с сетками Горяева. Сетка Горяева состоит из 225 больших квадратов (15*15). Большие квадраты, расчерченные вертикально и горизонтально на 16 малых квадратов, чередуются с квадратами, разделенными только вертикальными или горизонтальными линиями, и с квадратами чистыми, без линий.

Глубина камеры равна 1/10 мм, сторона малого квадрата — 1/20 мм, объем малого квадрата равен 14 000 мм3.

Перед заполнением камеру и шлифованное покровное стекло моют и сушат. Покровное стекло притирают к камере так, чтобы появились радужные кольца. Каплю разведенной крови вносят пипеткой под притертое покровное стекло камеры. После заполнения камеру оставляют на 1—2 мин в покое для оседания форменных элементов, затем приступают к подсчету при малом увеличении микроскопа в затемненном поле зрения (прикрытой диафрагме и опущенном конденсоре). Эритроциты считают в 5 больших квадратах (5*16 = 80 малым квадратам), расположенных по диагонали. Для этого отыскивают левый верхний большой разграфленный квадрат, подсчитывают количество находившихся в нем эритроцитов, затем по диагонали вниз и направо находят следующий такой квадрат и т.д.

Для того чтобы дважды не сосчитать одни и те же клетки, лежащие на пограничных линиях, соблюдают правило: к данному квадрату принадлежат клетки, находящиеся большей своей частью внутри него, разделенные пограничной линией (считают только на верхней и левой границе квадрата).

Количество эритроцитов в 1 мл крови рассчитывают путем деления произведения из числа сосчитанных эритроцитов (а), 4000 (приведение к объему 1 мкл крови) и 200 (степень разведения) — а*4000*200*80 (количество малых квадратов).

При взаимосокращении получается произведение — а*10 000, т.е. число подсчитанных эритроцитов в 5 больших квадратах на 10 000. Ошибка метода в среднем равна ± 2,5%.

Электронно-автоматический метод

Наибольшее распространение нашел импульсный принцип, основанный на разнице электропроводности частиц крови и жидкости, используемой для разбавления. На нем работают счетчики «Целлоскоп» (Швеция) и «Культер» (Франция).

Кровяные тельца, взвешенные в изотоническом растворе хлорида натрия, всасываются через микроотверстие диаметром 100 мкм, с обеих сторон которого подведено по одному платиновому электроду. Скачкообразные повышения сопротивления, возникающие при прохождении частиц крови через капилляр, вызывают электрические импульсы, амплитуда которых прямо пропорциональна объему частиц. Импульсы усиливаются, подсчитываются в электронном устройстве.

Производительность аппаратов этого типа велика: весь процесс от введения образца до получения результата происходит в течение 20 сек. при ошибке 1—2%.

Индексы красной крови имеют значение для суждения о нормо-, гипер- и гипохромии эритроцитов. Под индексами красной крови понимают среднее содержание гемоглобина в одном эритроците и цветовой показатель.

Далее по теме:

www.medkurs.ru

Количество эритроцитов в крови

Взятие крови можно производить меланжерным (в меланжеры или смесители) или пробирочным методом (в пробирки, по Н.М.Николаеву) с последующим подсчетом количества эритроцитов в крови счетной камере под микроскопом. Подсчитывают эритроциты в крови и в фотоэлектрическом эритрогемометре, а также с помощью целлоскопа. В качестве разводящего раствора чаще всего используется изотонический раствор хлорида натрия.

Количество эритроцитов в крови - как рассчитать?

Наиболее распространенным является метод подсчета количества эритроцитов в камерах Бюркера с сеткой Горяева. Для этого кровь из пальца набирают в меланжер до метки 0,5, затем физиологическим раствором хлорида натрия доводят до метки 100 (разведение в 200 раз). Полученную взвесь эритроцитов в крови тщательно перемешивают, покручивая меланжер, затем ею заполняют камеру, подсчитывают количество эритроцитов в пяти больших квадратах сетки Горяева и к полученной цифре добавляют четыре нуля. Нормальное количество эритроцитов у женщин в крови 3,8 x 1012 – 5,5 х 1012 /л, у мужчин 4,5 х 1012 – 5,0 х 1012 /л.

Индексы красной крови – это среднее количество гемоглобина в одном эритроците и цветовой показатель. Определение среднего количества гемоглобина в одном эритроците в крови производят делением концентрации гемоглобина на число эритроцитов в 1 мкл. В норме 1 эритроцит содержит 33х 10-8 мкг, или 33 пг гемоглобина (1 пг = 1х10-12 г). Допускаются колебания от 27 до 33,4 пг.

Величину 33 пг, составляющую норму содержания гемоглобина в одном эритроците, условно принимают за единицу и обозначают как цветовой показатель. По цветовому показателю судят о том, является ли содержание гемоглобина в эритроцитах исследуемого лица нормальным, пониженным или повышенным по отношению к норме. Гиперхромия, т.е. увеличение среднего содержания гемоглобина в одном эритроците, дающее цветовой показатель выше единицы, зависит исключительно от увеличения объема эритроцитов, а не от повышенного насыщения их гемоглобином. Перенасыщения гемоглобином не бывает, нормальный эритроцит насыщен им до предела. На практике вычисление цветового показателя производят по формуле:

ЦП = 3 x гемоглобин ( в г/л) / три первые цифры числа эритроцитов в миллионах

В норме цветовой показатель колеблется от 0,85 до 1,15.

Определение гематокритного числа эритроцитов в крови

Определение гематокритного числа в крови дает представление о соотношении между объемом форменных элементов и объемом плазмы. Гематокритное число в крови определяется методом центрифугирования крови в градуированных гематокритных трубках, капиллярах или путем расчета в автоанализаторах. Гематокрит – это два коротких стеклянных градуированных на 100 делений капилляра с диаметром просвета около 1 мм в специальной насадке, которая крепится на вертикальном валу двигателя центрифуги.

Капилляры предварительно обрабатываются антикоагулянтом. Затем в них насасывают венозную или капиллярную кровь и центрифугируют в стандартных условиях, либо в обычных центрифугах со скоростью 3000 об/мин, либо в специальных центрифугах при 16 500 об/мин в течении 1 мин. Форменные элементы крови, как имеющие больший удельный вес, под влиянием центробежной силы оседают у дистального конца капилляра.

Нормальные величины гематокритного числа у мужчин колеблются в пределах 40/60 – 48/52 или 40 – 48%, у женщин 36/64 – 42/58 или 36 – 42%,

Увеличение клеточной массы крови называется полицитемией, а уменьшение – олигоцитемией.

Определение диаметра эритроцитов в крови

Измерение диаметра эритроцитов в крови и графическую регистрацию распределения эритроцитов в крови по величине (эритроцитометрическая кривая, кривая Прайса – Джонса) можно производить с помощью прямых микроскопических и электронно-автоматических методов. Прямой микроскопический метод измерения диаметра эритроцитов чрезвычайно трудоемок и поэтому лучше пользоваться электронно -автоматическим методом.

Эритроцитометрическая кривая Прайса – Джонса в норме правильной формы с вершиной («пиком») на 7,2 мкм и довольно узким основанием в пределах 6 – 9 мкм.

Определение осмотической резистентности эритроцитов в крови

Принцип метода состоит в том, что эритроциты в гипертонических солевых растворах сморщиваются, а в гипотонических набухают. При значительном набухании наступает гемолиз. В пробирки с раствором хлорида натрия различной концентрации (от 0,70 до 0,22 %) вносят один и тот же объем крови (0,02 мм).

Через час пробирки центрифугируют и определяют начало гемолиза по легкому порозовению раствора, а полный гемолиз – по интенсивной красно-лаковой окраске раствора. В норме минимальная резистентность у взрослых людей колеблется между 0,40 и 0,46% хлорида натрия, максимальная – между 0,34 – 0,32 % хлорида натрия.

Определение количества ретикулоцитов – молодых эритроцитов в крови

Количество ретикулоцитов в крови по выходе из костного мозга в периферическую кровь в течение 6 ч превращается в зрелый эритроцит. Количество молодых эритроцитов подсчитывают в мазках крови, прижизненно окрашенных 1%-ным раствором бриллианткрезилблау. Для этого на предметное стекло с раствором бриллианткрезилблау наносят каплю крови и готовят мазок. Этот мазок помещают во влажную камеру на 10 мин. После этого его подсушивают на воздухе и считают количество ретикулоцитов в крови под иммерсионным объективом по отношению к 1000 эритроцитов. Результаты исследования выражают в промилле (%о). В норме содержание их в периферической крови составляет 2 – 10%о.

Определение скорости оседания эритроцитов (СОЭ) в крови

За пределами кровеносного русла (если предотвращено свертывание крови) клетки крови оседают (седементируют), оставляя сверху слой плазмы. Этот феномен лежит в основе определения скорости оседания эритроцитов (СОЭ) в крови, которая выражается в миллиметрах плазмы, отстаивающейся в течение часа. Оседанию эритроцитов предшествует их агрегация типа монетных столбиков. От того, как происходит их формирование, и зависит СОЭ.

Наиболее распространен микрометод определения СОЭ в модификации Панченкова. Для этого используют специальные градуированные капиллярные пипетки, имеющие просвет в 1 мм и длину 100 мм. Пипетку предварительно промывают антикоагулянтом – 3,7%-ным раствором цитрата натрия. Затем набирают в нее этот раствор до метки «Р» и выливают в видалевскую пробирку. Далее той же капиллярной пипеткой из пальца набирают два раза кровь до метки «К» и выливают ее каждый раз в ту же пробирку.

Хорошо смешав, насасывают смесь в пипетку до отметки «О», отмечают время и ставят ее в штатив. Через час отсчитывают по делениям на капиллярной пипетке величину отстоявшегося столбика плазмы. Записывают величину СОЭ в миллиметрах в час. В норме у женщин она составляет до 14 – 15 мм в час, у мужчин – до 10 мм в час. СОЭ увеличивается у женщин во время беременности (после 3-го месяца) и остается повышенной около трех недель после родов (что зависит от увеличения объема плазмы, повышения содержания в крови глобулинов, холестерина и уменьшения содержания кальция), во время менструации (умеренно). Ускорение оседания эритроцитов наблюдается при сухоедении и голодании.

www.medmoon.ru

Метод подсчета количества эритроцитов в крови с помощью камеры Горяева

Состав крови образован плазмой и форменными компонентами, большую часть из которых составляют эритроциты. Зрелые кровяные клетки не содержат ядра и имеют двояковогнутую форму. Главная их функция – транспортировка газов в тканях органов. Уровень эритроцитарных клеток в крови человека зависим от таких факторов, как пол и возраст, но является величиной достаточно постоянной, поэтому колебание их количества дает ценную информацию в процессе диагностирования.

Для вычисления количества кровяных клеток чаще всего используется унифицированный метод подсчета эритроцитов с использованием оборудования, известного, как камера Горяева, либо с помощью электронных счетчиков автоматического типа. Оба способа на данный момент широко используются и в ежедневной лабораторной практике, и при научных изысканиях, так как погрешность результатов, полученных в ходе их применения, минимальна.

Строение камеры Горяева

Оптическое устройство – камера Горяева позволяет вычислить количество кровяных клеток в определенном объёме специальной жидкости. Идея создания устройства принадлежит русскому профессору Горяеву Н. К.

Главный элемент устройства – прозрачное предметное стекло с камерой, образованной углублением в форме прямоугольника, поверхность которой покрыта специальной микроскопической сеткой, и тонкое покровное стекло. Высокая точность результатов подсчета достигается благодаря повышенному объёму сетки в сравнении с аналогичными устройствами других типов.

Сетка устройства имеет площадь 9 мм2, размер одной стороны составляет 3 мм. Поверхность данного элемента образована квадратами общим числом в 225 шт. Из них одна сотня квадратов поделена на прямоугольники, еще столько же – не разграфлено, а 25 штук поделены на 16 более маленьких. Площадь 1 малого квадрата составляет 1/400 мм2, область над ним имеет объём 1/4000 мм3.

Разбавление крови с целью исследования

Определение количества эритроцитов состоит из нескольких последовательных действий. Первым этапом становится разведение определенного объёма крови в реагенте. Делается это в связи с огромным числом форменных элементов.

В качестве реагента чаще всего выступает раствор хлорида натрия концентрацией 0,9%. При необходимости альтернативой служит 5% раствор натрия цитрата. Процедуру разбавления крови выполняют в пробирке или в специальном смесителе, называемом меланжером.

Внимание! Использование растворов с более высокой или низкой концентрацией исключено, так как повлечет за собой разрушение кровяных клеток.

Разбавление крови в меланжере

Меланжером называется изготовленный из стекла градуированный капилляр длинной 10 см с расширением на конце, внутри которого расположен шарик. Последний выполняет важную функцию – равномерное смешивание раствора и крови. Цвет шарика меланжерного капилляра будет красным, если он предназначен для эритроцитов, и белым – для работы с лейкоцитами.

Методика подсчета эритроцитов позволяет проводить процедуру исследования и со стабилизированной кровью, и с нестабилизированным материалом сразу после его забора у пациента.

Кровь набирают меланжерным капилляром до деления 0,5, после чего кончик смесителя очищают от крови с помощью марли либо ватки и следующим действием набирают разбавляющий раствор до деления 101. Перекрыв пальцами отверстия капилляра, полученный образец тщательно смешивают около 3 минут. В счётную камеру помещают четвёртую каплю, предварительно удалив первые три на марлю. Таким образом получают разбавление крови в 200 раз.

Разбавление крови в пробирке

При пробирочном методе разбавления крови исследуемый материал разводят в 200 раз следующим образом: 4 мл раствора хлорида натрия помещают в пробирку, после чего добавляют 0,02 мл крови.

Для этого забор материала производят пипеткой, кончик которой протирают ваткой или другой тканью. Образец крови помещают на дно пробирки, пипетку промывают ближе к поверхности раствором хлорида натрия. Готовый образец перемешивают и оставляют до дальнейшего этапа исследования, но менее чем на 3 часа.

Подсчет количества эритроцитов

Камера Горяева обязательно располагается горизонтально. Всю площадь сетки аккуратно заполняют разведенным образцом. Важно проследить, чтобы не образовались пузырьки воздуха, ведь их наличие значительно исказит результат. В таком положении камера остается в течение одной минуты с целью оседания кровяных клеток.

Унифицированный метод подсчета эритроцитов проходит при среднем увеличении посредством микроскопического осмотра. Подсчет числа эритроцитов в камере Горяева ведут в 5 больших квадратах, поделенных на 16 малых. Начало отсчета рекомендовано производить с большого квадрата, находящегося вверху слева, и далее по диагонали.

Важно! Чтобы количество клеток, находящихся на линиях малых квадратов, не было подсчитано дважды, рекомендуют пользоваться правилом Егорова: в каждом квадрате вести подсчет по двум определенным линиям (верхней и левой).

Начинают высчитывание клеток в малых квадратах в верхнем ряду слева направо от 1-го до 4-го в этом ряду. Переходя к следующему ряду, подсчет ведут в обратном порядке – справа налево. Переход к подсчету клеток в следующем большом квадрате производят после вычисления эритроцитов в этих 16 малых квадратах.

Непосредственно расчет числа эритроцитов ведут по формуле, отображенной на рисунке №2.

Обозначения в данной формуле расшифровываются следующим образом:

Внимание! Для достоверности результата расчет кровяных клеток при некоторых видах анемии необходимо проводить непосредственно после забора материала.

Возможные причины искажения результата

Как и любой другой лабораторный анализ, подсчет эритроцитов требует тщательной подготовки и аккуратности в исполнении. Искажение результатов анализа может возникнуть вследствие целого ряда причин. Оборудование хранят в сухом месте. Любая лабораторная работа, связанная с кровью, выполняется в резиновых перчатках.

Для начала следует убедиться в правильности подготовки и использования камеры. Перед работой и по ее окончании устройство необходимо тщательно промывать дистиллированной водой и насухо протирать мягкой тканью. Покровное стекло должно быть подготовлено заблаговременно таким же образом.

Возможные причины, влияющие на достоверность результата:

В последнее время все большую популярность получает метод подсчета эритроцитов с использованием электронных счетчиков автоматического типа. Такая тенденция вполне обоснованна, так как автоматизированный процесс исследования значительно точнее и менее трудоёмок.

Принцип действия данного оборудования основан на разном показателе электропроводности клеток крови и раствора, в котором они помещены. Специальное электромагнитное устройство регистрирует изменение уровня сопротивления электрической цепи, когда эритроциты движутся через отверстие капилляра. Уже через несколько секунд на цифровом табло высвечивается результат с высчитанным числом клеток.

Повышенный показатель красных кровяных клеток в анализе называется полицитемией. Данное состояние возникает вследствие патологий, характеризующихся потерей жидкости в организме, например при диарейном синдроме. Часто такое явление наблюдается на первых этапах инфекционных заболеваний, при отравлении токсичными веществами и прочем. Снижение же концентрации эритроцитов в крови известно как олигоцитемия. И зачастую такая патология проявляется во время различного вида анемии.

lechiserdce.ru


Смотрите также